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难点剖析知识·巧学一、目的基因的获取基因操作的第一步，是取得人们所需要的特定基因，也就是目的基因。例如，前面提到的苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子的储藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等，都是目的基因。1.从基因文库中获取目的基因要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，犹如大海捞针，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，概括地说，主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。知识拓展直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成基因的方法。2.利用PCR技术扩增目的基因20世纪80年代以后，随着DNA核苷酸序列分析技术的发展，人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出来的基因进行核苷酸序列分析，并且通过一种扩增DNA的新技术(也叫PCR技术)，使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。难点剖析PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR反应包括以下几个主要过程：第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。知识拓展目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录。（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、基因表达载体的构建将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个切口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成了一个重组DNA分子。例如，人的胰岛素基因就是通过这种方式与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子(也叫重组质粒)的。除了目的基因，构建基因表达载体，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。疑点突破在构建基因表达载体时，主要考虑以下几方面的因素：（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体内加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。三、将目的基因导入受体细胞目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。用人工的方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1.将目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。知识拓展农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L阿拉伯糖、D木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致TDNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。2.将目的基因导入动物细胞：显微注射法。3.将目的基因导入微生物细胞：如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。四、目的基因的检测与鉴定以上步骤完成以后，在全部受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。要点提示大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。2.检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能的第一步。3.检测目的基因是否翻译成了蛋白质。重组的DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。例如，科学家最初做抗虫棉试验时，虽然已经检测出棉的植株中含有抗虫的基因，但让棉铃虫食用棉的叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明抗虫基因还不能在高等植物中表达。科学家在研究的基础上，又一次对棉植株中的抗虫基因进行了修饰，然后再让棉铃虫食用棉的叶片，结果食用的第二天棉铃虫就中毒死亡了。这说明抗虫基因在棉植株中得到了表达。辨析比较目的基因的检测与鉴定内容和方法的比较类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等问题·探究问题1构建基因文库是获取目的基因的唯一方式吗？探究：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。问题2为何要构建基因表达载体？探究：由于单独的DNA片段——目的基因是不能稳定遗传的，因此若要使目的基因在受体细胞中保持稳定和表达，就需要将目的基因与相应载体结合，形成重组结构，即基因表达载体。以保证目的基因导入相应受体细胞后，一方面能稳定存在并遗传；另一方面，能表达和发挥作用。基因表达载体的组成必须要有目的基因、启动子、终止子和标记基因等。典题·热题例1采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是…()①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，构建成基因表达载体，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A.①②B.②③C.③④D.①④解析：本题考查了基因工程的步骤。培育抗虫棉时，是从苏云金芽孢杆菌中提取目的基因，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养。将目的基因与质粒重组后，注射到棉的子房内，并进入受精卵，这种方法也是可行的。将毒素蛋白注射到棉的受精卵中或将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉的受精卵中，都不是导入目的基因的方法。答案：C巧解提示用人工的方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。注意题干关键词是目的基因和体细胞。例2下列技术不是依据DNA分子杂交原理的是()A.用DNA分子探针诊断疾病B.检测目的基因是否导入受体细胞C.快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量D.目的基因与载体结合构建基因表达载体解析：本题考查基因工程的应用。解答本题时应从以下几方面分析：（1）基因诊断是用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子作探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。（2）检测目的基因是否导入受体细胞可采用DNA分子杂交技术来进行，将转基因生物的目的基因标记作探针，与受体基因组DNA杂交，根据杂交带的显示情况来确定。（3）使用一个特定的DNA片段制成探针，与被检测的病毒DNA杂交，可以把饮用水中的病毒检测出来。（4）目的基因与载体结合形成重组DNA分子利用的原理是基因重组，而不进行DNA分子杂交。答案：D深化升华DNA分子杂交的基础是具有互补碱基序列的DNA分子,可以通过碱基对之间形成氢键等,形成稳定的双链区，目的