传统方法在临床细菌学鉴定中的作用

传统方法在临床细菌学鉴定中的作用微生物分析仪的使用加强了传统细菌学鉴定的薄弱环节，同时通过细菌形态、染色性等确认，保证了仪器鉴定的准确性。近十年来，随着检验医学的发展，临床细菌学检验日益受到重视，我们应充分发挥传统方法和先进仪器的优势，促进临床细菌学检验技术的进一步提高。1、分离培养是临床细菌学不可缺少的基本技术，是获得纯培养物(纯菌)的必要手段，即使自动化仪器再先进也只能对纯菌做出鉴定。对细菌生长繁殖特性的观察也是必不可少的。需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌通过常规培养方法容易区别，否则容易把兼性厌氧菌当厌氧菌鉴定。细菌对营养的要求、温度、酸碱度、耐盐性等也是鉴定依据，如奈瑟菌属的细菌形态相似，但淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌要在血琼脂上生长，其他奈瑟菌可在营养琼脂上生长；葡萄球菌在营养琼脂上生长，但链球菌在血琼脂上才能生长良好；肠球菌、李斯特菌和绿色气球菌在6.5％NaCl中生长良好，而D群链球菌(非肠球菌)不生长；空肠弯曲菌在42℃生长，在25℃就不生长；霍乱弧菌在碱性琼脂上生长良好，嗜血杆菌宜在5％-10％CO2环境下培养等。2、细菌的菌落、色素、溶血性、气味是鉴定的重要特征。如：葡萄球菌在羊血琼脂上的菌落直径大于链球菌，溶血性仍用于链球菌生化鉴定；普通变形杆菌、奇异变形杆菌和溶藻弧菌均能迁徙生长，但变形杆菌有恶臭味；而菌落扁平、边缘锯齿状、具有生姜味、产生绿色素、有金属光泽者容易辨认绿脓假单胞菌，细菌产生红色素(黏质沙雷菌)、紫色素(紫色色杆菌)、黄色素(聚团肠杆菌、板畸肠杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌等)、橙红色素(红球菌)等均可缩小鉴定范围；菌落呈蜡样(蜡样芽孢杆菌)、胶胨状(克雷伯菌和黏性绿脓假单胞菌)、表面颗粒状(结核分枝杆菌、奴卡菌)也是相应细菌的特征。半固体培养可直接观察细菌的动力，适用于沙门菌属鞭毛抗原的诱导。肉汤生长物特别适合观察细菌的排列，在液体中细菌的排列完全展开，如链球菌的链状典型，便于区别微球菌科内其他的细菌，此外，还可观察绿脓假单胞菌色素和需氧菌在液面上形成的菌膜。3、形态学在细菌鉴定中非常重要，如奴卡菌、红球菌。对标本直接涂片根据镜检结果结合临床还可快速诊断，如泌尿生殖道标本涂片中见到典型肾形的革兰阴性双球菌分布于白细胞内外，可诊断为淋病。明确革兰染色性是细菌鉴定的前提，革兰染色错误肯定细菌鉴定有误，即使使用自动化仪器也是如此。同时菌体形态、染色性的观察可以修正仪器出现的错误报告。如形态观察很容易区另Ij细菌和酵母样菌，完全可以避免误报；莫拉菌属、不动杆菌属的形态可区分其他常见非发酵的杆菌。革兰阳性菌或阴性菌、阳性球菌或杆菌，阴性球菌或杆菌决定了对细菌采用何种鉴定系统。传统方法中对染色性不定的细菌，还通过进行万古霉素纸片法敏感试验和3％KOH拉丝试验，起到佐证作用。革兰阳性菌通常对万古霉素敏感、拉丝试验阴性；革兰阴性菌则相反。抗酸染色确定抗酸杆菌，改良金泳染色是奴卡菌、红球菌的鉴定试验之一。鞭毛染色常用于非发酵菌鉴定，应用芽胞、异染颗粒和荚膜染色在相关细菌确认上都是重要特征。4、动力在各种细菌鉴定中是简便而关键的试验，如李斯特菌、肠球菌、D群链球菌、绿色气球菌，它们都是胆汁七叶苷阳性，而且形态不易区分，但李斯特菌有动力(25℃)，很容易区别；小肠结肠炎耶尔森菌在22~C-25℃有动力，但在35℃无动力。志贺菌属无动力，沙门菌属有动力；黄杆菌属无动力，很容易区别有动力的非发酵的杆菌等。5、氧化酶、触酶试验分别是革兰阴性菌、革兰阳性菌鉴定的关键试验，需要传统方法测试，仪器也要依据上述试验结果，选择相应的鉴定卡。氧化酶错误可使细菌鉴定错在科水平，如将气单胞菌误认为肠杆菌科细菌。触酶错误不可能准确鉴定微球菌科细菌，对触酶阳性发酵的革兰阳性球菌必须先确定血浆凝固酶阳性，仪器才会报告金黄色葡萄球菌。6、传统的鉴定方法通过优选试验项目，同一科内的不同属、种可以选择不同的鉴定指标，具有灵活性。大肠埃希菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌等常见病原菌都能简便地鉴定出来。采用稳定、优质的商品生化微量管，将使生化培养基的使用变得方便，且成本低廉。7、志贺菌属、沙门菌属、致病性大肠埃希菌等仅需几项简单试验即可确定菌属，即使自动化仪器也离不开传统的血清学试验确定型别。链球菌属已有快速分群凝集试验。8、传统方法的不足：传统方法手工操作较繁杂，鉴定细菌至少需要18-24h，而仪器可在几小时内报告结果。但主要还是下述问题制约着传统方法的进一步发展：(1)疑难菌、少见菌、苛养菌鉴定是薄弱之处，它们生长较慢、营养要求高，如结核分枝杆菌、巴斯德菌属、嗜血杆菌属、弯曲菌属、螺菌属、军团菌属、棒状杆菌属等在中小实验室分离甚少，这些细菌虽然没有取代传统的病原菌，但有增多趋势，需加强这些细菌鉴定方法的研究和规范化。同时，还应创造条件普及厌氧菌培养和鉴定，满足因病原菌感染所致疾病的诊断、治疗的要求。(2)广大中小实验室在提高常见病原菌鉴定水平的基础上，应掌握疑难菌、少见菌、苛养菌的检验技术，不要放弃临床标本中遇到的不熟悉的细菌，按科-属-呻种原则鉴定，也便于发现“新的细菌”，而且对“新菌”的鉴定可以拓展思路，提高细菌鉴定的水平，必要时将可疑菌送到上级实验室或用仪器鉴定。还应大力加强细菌检验人员的培训，提高业务素质。(3)加强国产培养基的研制。优质的培养基是分离、培养病原菌的关键。苛养菌、血液增菌培养瓶、结核分枝杆菌等商品培养基应大力开发，以适应临床细菌学检验技术的需要。全自动微生物鉴定专家系统的临床应用与评价北京医院检验科（胡去建、许宏涛、张秀珍）；湖南医科大学检验系（肖春海）为了有效控制和治疗传染性疾病，快速和准确获得细菌的药敏结果是非常必要的。近10多年来随着计算机的发展及广泛应用，先后出现了许多自动与半自动细菌鉴定与药敏系统，VITEK系统即为其中之一。由于药敏结果的可靠性直接关系到临床的治疗效果，但是对体外药敏试验的结果下解释，需要掌握多方面知识：如细菌的耐药机理及对应的表型，细菌的天然耐药性，细菌群体中的最低抑菌浓度（MIC）分布，药物的化学结构及作用方式，体液及组织中药物代谢动力学，体外测试结果与治疗效果的关系等，这些都是由少数专家来完成。于是VITEK系统中设置了专家系统对药敏结果进行审核分析和解释。一、什么是专家系统专家系统是根据抗生素的种类，细菌的种类与目前美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）及其他出版的数据信息为药敏结果提供推论性的解释说明。专家系统这一名称也是首次出现在美国微生物学会1999年出版的第7版临床微生物手册中。专家系统自动监测VITEK药敏结果中的异常表型，并对常见耐药表型机制进行评估和推断，即本身是一个提示，出现专家系统即有提示。二、专家系统的组成VITEK专家系统共有144条规则，包括3个等级。1．一级专家系统：是对报告中极不可能或从未出现过的表型的警告。例如：药敏结果中出现金黄色葡萄球菌耐万古霉素，则是不可能的表现型。到目前为止未见有报道金黄色葡萄球菌耐万古霉素，要求重复鉴定或药敏试验给予证实，否则系统不予通过。2．二级专家系统：是对报告中罕见表型的提示。例如：如果是洋葱伯克霍德菌对氨基糖苷类抗生素和亚胺培南敏感，则是罕见表型，因为洋葱伯克霍德菌对上述两种抗生素天然耐药，也要求重复鉴定或药敏试验给予证实。3．三级专家系统：是利用一种耐药表型推断另外一些药物的耐药性或提示药敏结果中的耐药机理。例如：如是肠杆菌对环丙沙星耐药，则对其他喹诺酮抗生素耐药。三、专定系统的临床应用我们通过用VITEK对常规培养分离出来816株细菌进行鉴定和药敏试验，了解其药敏结果出现的专家系统情况，并对结果中出现的一、二级专家系统的解释进行手工纸片扩散布法验证和鉴定试验。1．816株细菌经VITEK-IMS60全自动微生物鉴定系统（为生物梅里埃公司产品）的革兰阳性菌鉴定卡（GPI卡）和革兰阴性菌鉴定卡（GNI卡）鉴定结果见表1，这些细菌均为临床上常见的细菌。表1VITEK对816株细菌鉴定结果GNI卡株数（511）GPI卡株数（305）绿脓假单胞菌不动杆菌属沙雷菌属大肠埃希菌克雷伯蓖属枸橼酸杆菌属阴沟肠杆菌产气肠杆菌8372169573355128MSSAMRSAMSCNSMRCNS肠球菌属无乳链球菌其他细菌42306243742430变形杆菌其他细菌1939合计816注：MSSA：苯唑西林敏感金黄色葡萄球菌；MRSA：耐苯唑西林金黄色葡萄球菌；MSCNS：苯唑西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌：MRCNS：耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌2.816株细菌根据细菌的种类不同上相应药敏卡，葡萄球菌药敏卡（GPS-SD卡）、链球菌药敏卡（GPS-TA）、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏卡（GNS-NT）、其他革兰阴性菌药敏卡（GNS-F3和GNS-F5卡），专家系统版本为VTK-R7.01。出现专家系统的情况（如果1株细菌出现2条或2条以上的专家系统，按最高级的1条计算）见表2，共有489株细菌出现专家系统，约占60%。327株细菌无专家系统推荐，表示该试卡显示的耐药表型符合该细菌已知耐药机制的表达，或目前对该细菌耐药表型还未获得可推荐的规则。表2816株细菌出现专家系统的情况一级专家系统二级专家系统三级专家系统无专家系统推荐384.7%（38/816）394.8%（39/816）41250.5%（412/816）32740.0%（327/816）3．对一、二级专家系统所提示的内容用纸片扩散法验证药敏试验所用材料为英国OXOID公司产品；API试纸条为生物梅里埃公司产品，用于重复鉴定，验证结果见表3。表3一、二级专家系统经验证后的情况专家系统出现的次数符合专家系统的次数（%）不符合专家系统的次数（%）一级二级383928（74）32（82）10（26）7（18）合计7760（78）17（22）在一级专家系统中，28次经验证后符合专家系统，出现的原因是多种多样，分布于操作（金黄色葡萄球菌耐万古霉素和无乳链球菌耐青霉素的原因为菌落不纯）、人为的判断（屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌的试卡上的生化反应非常接近，只有通过30°是否有动力和菌落是否有黄色色素才能区分，如果只从概率高低把铅黄肠球菌输入一个对万古霉素敏感的药敏卡，就会获得一级专家系统，为铅黄肠球菌天然耐万古霉素）和仪器因素（大肠埃希菌对一代喹诺酮抗生素萘啶酸敏感，而对二代三喹诺酮抗生素或环丙沙星结果耐药，纸片扩散法验证药敏试验发现在萘啶酸纸片的周围有耐药菌株）等多方面。10次不符合专家系统的细菌为鲍曼不动杆菌和绿逐假单胞菌对试卡（GNS-F3）中全部抗生素耐药，经验证为全部耐药。在二级专家系统中，经验证后82%都符合专家系统，说明大多数细菌的耐药模式在世界范围是基本相同，出现专家系统的原因基本上与一级专家系统相同。7次不符合，则说明这7株菌确为罕见表型。四、专家系统的意义仪器鉴定与药敏受多种因素影响，如菌落不纯，菌悬液浓度不标准，操作时药敏卡暴露于室温过长使部分抗生素受热后效价下降等因素都可使仪器药敏结果不准确。因而很有必要对其结果的可靠程度进行评估，由于临床微生物室的工作人员不可能记忆如此多的信息，而VITEK系统中的专家系统正是为此而设置的，即通过计算机的帮助证实药敏结果。在816株细菌的药敏结果中，共有489株细菌出现专家系统，约占60%。其中一级专家系统和二级专家系统共占77次，经验证后一、二级专家系统中提示正确为仪器药敏错误为78%，这大大提高了药敏结果的准确性。同时在412次三级专家系统中发现，它对目前全世界关注的特殊菌的耐药性进行监测：耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCoN）；耐万古霉素的肠球菌（VRE）和高水平耐氨基糖苷类抗生素的肠球菌（HLAR）；产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等等，以及利用一种耐药表型推断另外一些药物的耐药机理。长期应用，提高了临床微生物室的工作人员对抗生素方面和知识的理论基础。当前细菌的耐药性日趋复杂，新的问题不断出现，而且专家系统