低温胁迫对玉米幼苗抗冷性的影响-张志强

低温胁迫对玉米幼苗抗冷性的影响班级：生物科学1202学号：A09120033姓名：张志强低温胁迫对玉米幼苗抗冷性的影响生物科学1202A09120033张志强摘要:文章研究了以25℃为对照,用4℃的低温24h后胁迫处理玉米幼苗，以研究玉米幼苗的的冷伤害和抗冷性。结果表明,低温对玉米幼苗造成显著伤害,表现为叶绿素含量减少,根系活力降低,生物膜的通透性增大，过氧化物酶活性降低等。冷伤害程度与胁迫温度、胁迫时间密切相关。关键词:玉米幼苗；冷害；低温胁迫；抗冷性；叶绿素含量；根系活力；过氧化物酶活性；电导率引言对农业生产来说，各种不良环境是影响产量的最直接、最大的因素，因此，加强植物抗性生理的研究，探明植物在不良环境下的生命活动规律，了解植物的适应和逆境伤害机制并加以人为调控，对于农业高产稳产和保护生态环境具有极其重要的意义。植物的抗寒性分为抗冷性和抗冻性。许多喜温植物虽然不能抵抗零度以下低温的冰冻伤害,但对零度以上低温具有一定的忍耐性,即具有抗冷性。低温在一定程度上破坏细胞膜,从而影响膜系统维持的生理功能[1]。研究指出,大部分植物在温度介于0～15℃之间时一系列生理功能被破坏[1，2]。根据对低温的抗性将植物分为两类:低温敏感型,如玉米(极限温度5℃)，香蕉(极限温度15℃)；低温非敏感型,这类植物在0～15℃之间时受冷害的迹象不明显。另一方面,植物对冷胁迫具有忍受力,表现出许多从而提高低温忍受力,如可溶性蛋白、糖及游离氨基酸含量升高,产生较多的胁迫激素ABA等[3]。不同植物,甚至同一植物低温适应性反应由于原产地不同,其忍耐低温的能力不同。低温冷害是限制植物分布及农业生产的重要因素,也是植物引种必须首先考虑的问题[4]。研究表明,植物的低温伤害机理首先涉及到对膜系统的破坏,膜脂相变,从而影响膜系统维持的生理功能[5]。黑龙江属高寒地区,玉米为低温敏感型植物，极限温度为4℃，是我国北方主要栽培作物之一，是改善人民生活，出口外贸的重要物质之一，对发展农业、畜牧业具有十分重要的意义。因此此次研究低温胁迫对玉米的伤害有重大的实际意义。1．材料与方法1.1试验材料本试验所用材料为良玉188和九单57两种不同品种的玉米种子(由东北农业大学生命科学学院研究室供)。取玉米种子,各500粒，用蒸馏水将玉米种子洗净，放入大烧杯室温下在蒸馏水中。先用75%酒精浸泡10s后用蒸馏水洗净残余酒精，再用5%次氯酸钙浸泡20min后用蒸馏水洗净，加蒸馏水没过种子，37℃恒温暗培养进行催芽。12h后，用蒸馏水洗三次，洗去种子表面抑制生长的物质。将大烧杯中水倒净，用干净的湿布塞住烧杯口，加盖培养皿保持水分，37℃恒温暗培养，每隔12h左右用蒸馏水清洗一次种子。种子萌发后，用砂土培养法[6]将玉米种子种植于砂基培养皿中,保证每天光照12h,室温为25±2℃，生长至3叶一心,供低温处理之用。1.2处理方法将每个品种的供试材料分为两组,一组于原处继续生长,另一组移至4℃冰柜进行低温胁迫分别处理24h，分别于常温对照和低温处理处取材，测定其生理生化指标。1.3生理生化指标的测定及方法1.3.1叶绿素的定量测定1.称取剪碎的新鲜植物叶片0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2至3ml体积分数为95%的乙醇，研成匀浆，再加入乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3至5分钟。2.将提取液过滤到25ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀。3.将提取液倒入1cm比色杯内。以体积分数为95%的乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。4.计算649665AA6.88-13.95AC(mg/L)A7.32-24.96AC649665B(mg/L)A18.086.63ACCC649665BAT(mg/L)1000g/g/mg）（）（）（）叶绿素含量（WLVLmgCT式中V提取液体积W样品鲜重1.3.2外渗电导率1.称取0.5g的叶片组织（对照组与处理组各0.5g），放入洁净小烧杯中。2.将处理组置于冷冻层15分钟后，待室温，用抽气机对两烧杯溶液进行抽气。3.将叶片置于小烧杯中摇匀，对照组与处理组均各摇10min。4.用电导仪测其初始电导值S1t、S1ck,。5.测毕，将小烧杯置于沸水以杀死植物组织，取出试管后冷却至室温，在室温下平衡10min后,测量终末电导率S2t、S2ck.6.计算，将得到的电导率S1、S2代入下面公式中，计算伤害度：0201S-SS-SL式中S0为所用蒸馏水电导率ckcktL-1L-L伤害度×100%式中Lt为实验组伤害度Lck为对照组伤害度1.3.3根系活力测定1.标准曲线的制作2.分别称取四份根尖样品0.3g,三组作为实验组和一组对照组放入小烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液（pH=7.0）各5mL，对照组中加入2mLH2SO4,使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～2h，此后立即实验组中加入1mol/L硫酸2mL，以停止反应。3.再把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3～4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。4.计算）时间（）根种（）还原量（）还原强度（hggTTChggTTC/1.3.4过氧化物酶活性测定1.取0.3g叶片组织，放入研钵中，加入适量pH=5.5的磷酸缓冲液研磨成匀浆，将匀浆转入离心管中，以4000rpmin离心10min，用pH=5.5的磷酸缓冲液定容至10ml。2.实验组中依次加入2.9mlpH=5.5的磷酸缓冲液、1.0ml2%H2O2、1.0ml0.05mol/L愈创木酚和0.5ml酶液，放入37℃恒温锅中水浴15min，生成红色物质，并加入2.0ml20%的三氯乙酸以终止反应，然后在470nm波长下测定吸光度。3.对照组中先加入酶液0.5ml，需在沸水浴中灭活，其余步骤与实验组相同，在470nm波长作为空白组调零，测定实验组的吸光度值。4.计算，将得到的吸光度代入下列公式中，计算酶活性：tV0.01WVAst470过氧化酶活性式中A470470nm下的吸光度，以0.01为一个单位Vt酶液总体积W叶片组织质量Vs反应所用酶液体积t反应时间2.结果与分析2.1低温胁迫后叶绿素含量的变化表1：低温胁迫和正常情况下两种品种叶绿素含量测定品种温度/波长665nm649nm叶绿素含量（mg/g）良玉188常温0.8690.36016.95233低温0.7150.30210.91971九单57常温0.6110.2559.22047低温0.3870.1676.03855通过数据表明低温冷害处理后,叶绿素的含量显著降低,经4℃分别低温处理24h后良玉、九单的幼苗叶绿素含量仅为25℃正常处理幼苗叶绿素含量的64.4%、65.5%(表1,图1)。叶绿素含量（mg/g）024681012141618常温低温常温低温良玉188九单57叶绿素含量（mg/g）图1：低温胁迫对玉米幼苗叶绿素含量的影响分析叶绿素含量降低的原因如下:1)低温下SOD等保护酶的活性、含量降低,无法保护叶绿素不受自由基伤害,使含量降低。2)植物受低温冷害,光合系统最先受到攻击,光合系统的破坏使光合电子传递链相关产物积累,进而对光合系统产生毒害作用,同时破坏类囊体内的叶绿素[7]。由于低温,使生理代谢过程中产生的某些毒物(积累毒物)不能及时清除,这正是受到胁迫的植物叶绿素含量低的一个原因[4]。2.2低温胁迫后相对外渗电导率的变化根据实验数据(表2,图2)，外渗电导率（伤害率）随低温胁迫的变化表2：两种玉米种子幼苗外渗电导率品种S0S1S2S1'低温S2'低温LtLCK伤害率良玉1882.7446.5216.4184.54900.3710.24020.98%九单574.57178.1479161.05391.50.4050.15829.03%伤害率0.00%5.00%10.00%15.00%20.00%25.00%30.00%35.00%良玉188九单57伤害率图2：低温胁迫后伤害率的变化外渗电导率（伤害率）是反映生物膜通透性的重要参数,而膜的通透性是生命活力的指标之一。植物低温冷害中最核心的伤害是膜系统被低温破坏[7]。正常情况下细胞是一个完整的生物膜系统,其流动性与膜中磷脂的流动性有直接关系。生物膜中饱和磷脂与不饱和磷脂交替排列,整个系统以液晶状态存在。对低温敏感的植物的膜中含有较多的饱和脂肪酸,而抗性较强的植物的膜内含有较多的不饱和脂肪酸,以保证低温状态下膜的流动性。低温冷害可引起膜相分离,使不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸各自聚集在一起,此时细胞膜由流动镶嵌的液晶状态转变成凝胶状态,从而使细胞膜的完整性受到破坏。同时膜上吸附有一定生理功能的离子如Ca2+脱落,伴随细胞内部离子外渗,从而使细胞的外渗电导率增加。外渗电导率随冷害的加重而升高显示了细胞膜所受的伤害程度随冷害而加重的过程。2.3低温胁迫后根系活力的变化玉米根系不仅是水分和肥料的吸收器官,而且还具有氨基酸和激素的合成以及转化等多种功能。从(表4,图4)可以看出,低温胁迫后,两个品种的根系活力出现了不同程度的变化，这说明低温胁迫会使根受到不同程度的伤害。表3：两种种子在不同温度下处理后在A485下的吸光值品种九单57良玉188TTC还原强度（µg/g·h）（九单57）（良玉188）室温0.0260.02628.888628.8886低温0.0220.02124.444223.3331TTC还原强度05101520253035九单57良玉188TTC还原强度（µg/g·h）室温低温图3：低温胁迫对玉米幼苗根系活力的影响由TTC还原强度的变化可知(表3,图3),脱氢酶的活性因低温冷害的加深有显著的下降,从一个侧面反映出整个根系的活力随低温冷害的加重而降低。分析原因可能是由于脱氢酶的合成受阻,分解加剧,也不排除部分脱氢酶的构象在低温胁迫下产生了变化或者受到某种低温积累抑制物的影响而不再具有生理活性。脱氢酶生理活性的降低进一步导致根系呼吸代谢速率的降低,由此可间接的反映根系的ATP供给情况,ATP供给的减少直接影响到植物对水分和无机盐的吸收。2.4低温胁迫后过氧化物酶活性的变化叶片中过氧化物酶的活性随冷害的加重而降低(图4，图4)。这是由于低温影响了相关RNA的转录、翻译,以及各种酶的生理活性,从而使过氧化物酶的合成减少,同时植物为抵御低温冷害而水解体内的部分蛋白质,使游离氨基酸,特别是脯氨酸增加,过氧化物酶的分解加剧,从而使其相对含量降低。这将从一定程度上抑制植物体对过氧化物的分解,由于过氧化物会对细胞产生一系列破坏(如不饱和脂肪酸被氧化,还原性的辅酶因子被氧化,某些酶活性,细胞信号改变等),过氧化物的升高将影响到整个植物体其他生理活动。图4：两种不同种子在不同温度下处理过后的ΔA470/Δt品种温度波长470nm过氧化物酶活性（mg/g）良玉188常温1.5152028.8低温0.7301106.2九单57常温1.3301773.3低温1.1271502.6过氧化物酶活性（mg/g）05001000150020002500常温低温常温低温良玉188九单57过氧化物酶活性（mg/g）图4:低温胁迫对玉米幼苗过氧化物酶活性的影响3.实验讨论3.1电导率与抗冷性的关系生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构,各种逆境对细胞的影响首先作用于生物膜,低温伤害也是如此。低温胁迫下,质膜的结构和功能受到伤害,导致细胞膜透性增大,电解质外渗,电导率增大,能够比较客观地反应植物在低温逆境中的伤害状况。本试验通过对九单和良玉两个品种进行室温与低温胁迫后幼苗的电导率的测定,从测定结果可知随着低温胁迫时间的增加，电导率不断增加。3.2脯氨酸含量与抗冷性的关系在低温条件下,脯氨酸的积累是对低温环境的一种保护反应,脯氨酸能调节植物细胞膜的稳定性,还具有清除活性氧和稳定细胞