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人肺癌细胞系中LASS2/TMSG-1mRNA和蛋白的表达及其意义徐海芹1李时荣2翁立新2王静媛2海岭2徐晓艳3*（1内蒙古医科大学基础医学院内蒙古呼和浩特010059.2内蒙古医科大学基础医学院病理学教研室，内蒙古呼和浩特010059.3内蒙古医科大学附属医院病理科，内蒙古呼和浩特010059。*通讯作者，E-mail:xxy_patho@163.com）基金项目：国家自然科学基金（81201854），内蒙古自然科学基金（2014MS0858）摘要:目的探讨LASS2/TMSG-1mRNA和蛋白在不同转移潜能人肺癌细胞系中的表达及其意义。方法采用MTT增殖实验、Transwell侵袭实验、划痕修复实验检测人肺巨细胞癌低转移亚系95C和高转移亚系95D两株细胞的增殖、侵袭及迁移能力；RT-PCR反应检测LASS2/TMSG-1的mRNA在两株细胞中的表达水平，Westernblot方法检测LASS2/TMSG-1的蛋白在两株细胞中的表达水平。结果MTT增殖实验显示，第二天~第五天95C、95D两细胞增殖差异均具有显著性（P均＜0.05），95D细胞的增殖能力强于95C；Transwell侵袭实验结果表明95D细胞的侵袭能力显著高于95C细胞（t=﹣20.62，P＜0.05）；划痕修复实验证实了95D细胞的迁移能力强于95C细胞（t=23.56，P＜0.05）；由此证明95D细胞为高转移亚系，95C细胞为低转移亚系。LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在95C细胞（低转移亚系）中的表达明显高于95D细胞（高转移亚系）中的表达，差异具有显著性（P均＜0.05）。结论LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在人肺癌低转移亚系中的表达显著高于在高转移亚系中的表达，证实了两者可能参与抑制人肺癌的增殖、侵袭及迁移过程。关键词:肺癌；LASS2/TMSG-1的mRNA；蛋白TheexpressionandsignificanceofLASS2/TMSG-1’smRNAandproteininhumanlungcancercelllinesXUHai-qin1,XUXiao-yan2,3,PEILu-tian2,3,LIShi-rong2,3,WENGLi-xin2,3,LIXiu-xia2,3DepartmentofpreclinicalmedicineInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,010059,ChinaDepartmentofPathology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,010059,ChinaDepartmentofPathology,InnerMongoliaMedicalUniversityAffiliatedHospital,Hohhot,010059,ChinaAbstract:PurposeToinvestigatetheexpressionandsignificanceofLASS2/TMSG-1mRNAandproteininhumanlungcancercelllineswithdifferentmetastaticpotentiality.MethodsTheproliferation,invasionandmigrationabilityofcellsweretestedbyMTT、Transwellassayandwoundhealingassay;theexpressionlevelofLASS2/TMSG-1proteininhumanlungcancercelllinesweredetectedbywesternblotandtheexpressionlevelofLASS2/TMSG-1mRNAinhumanlungcancercelllinesweredetectedbyRT-PCR.ResultsMTTproliferationtestverifiedthat95Dcellwasstrongerthan95C(P＜0.05);Transwellinvasionassayshowedthattheinvasionabilityof95Dwassignificantlyhigherthan95C(t=﹣20.62，P=0.00);woundhealingassayconfirmedthatthemigrationabilityof95Dwashigherthan95C(t=23.56，P=0.00).TheexpressionofLASS2/TMSG-1’smRNAandproteinin95Cwithlowmetastaticpotentialityweresignificantlyhigherthantheexpressionin95Dcellwithhighmetastaticpotentiality,thedifferencewassignificant(P0.05)ConclusionTheexpressionlevelsofLASS2/TMSG-1mRNAandproteininlungcancercelllineswithlowmetastaticpotentialityweresignificantlyhigherthanthatinlungcancercelllineswithhighmetastaticpotentiality,whichconfirmthatthetwotargetsareinvolvedintheproliferation、invasionandmigrationofhumanlungcancercells.Keywords:lungcancer;LASS2/TMSG-1’smRNA;LASS2/TMSG-1’sprotein近年来肺癌成为人类死亡的重要肿瘤之一，全球每年约1亿人死于肺癌[1]。目前研究表明，肺癌患者肿瘤的侵袭和转移是其恶性程度的主要标志，也是造成其生存率低、死亡率高的主要原因。因此，探讨造成肺癌侵袭、转移的重要机制，寻找与肺癌侵袭转移相关基因至关重要。TMSG-1蛋白是一个跨膜蛋白，有六个跨膜区，定位于内质网线粒体等细胞质膜系统。TMSG-1基因位于染色体1q21.2,cDNA全长为2kb.TMSG-1编码的蛋白质含380个氨基酸,分子质量为4500,包含有HOX、TLC两个功能域,属于LASS家族。LASS2(homosapienslongevityassurancehom-0109ue2)是2001年上海复旦大学遗传学研究所从人肝cDNA文库中克隆出的与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的新基因,与TMSG-1高度同源[2].研究表明TMSG-1可以促进神经酰胺合成，并且与肿瘤转移有密切的关系，包括抑制细胞生长，促进调亡，从而抑制肿瘤的侵袭和转移等。另外，其与质子泵V-ATPase的相互作用，可调节细胞内外的H+的量，从而抑制基质金属蛋白酶的分泌和激活。TMSG-1发挥的抑制肿瘤作用目前认为可能：①与液泡型ATP酶的功能有关；②与神经酰胺的合成有关；③促进细胞凋亡有关等[3,4,5]前期研究已发现TMSG-1能够抑制前列腺癌，肝细胞癌，肺癌、膀胱癌以及乳腺癌等多种肿瘤细胞的侵袭及转移能力，从而被认为是一种候选的肿瘤转移抑制基因。本文通过检测不同侵袭、转移潜能的人肺癌细胞中LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白的表达，进一步证实了两者是否参与抑制人肺癌的生长、侵袭及迁移过程，为两者与人肺癌侵袭、转移的关系及其相关性的研究奠定基础。1.材料与方法1.1.一般资料：人肺巨细胞癌低转移亚系95C、人肺巨细胞癌高转移亚系95D均购于上海复祥生物科技有限公司。胎牛血清和RPMI1640培养液购自Gibco公司；6孔细胞培养板和Transwell小室（内径6.5mm，孔径8.0μm）购自Corning公司；MatrigelTM购自BD公司；羊抗人多克隆抗体LASS2/TMSG-1购自北京博奥森有限公司；LASS2/TMSG-1工作浓度1：400；羊抗人单克隆抗体β-actin购自北京博奥森有限公司，工作浓度1:1000；Trizol购自invitrogen公司；RT试剂盒均购自Transgene基因有限公司。1.2.细胞系及细胞培养：人肺巨细胞癌高转移亚系95D细胞于上海复祥生物科技有限公司购买，此株细胞最早为北京301医院建株[10]。均用含10%（体积分数）小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%（体积分数）CO2孵育箱中培养。1.3.MTT法检测细胞增殖能力：收集对数期生长细胞，1ml0.25%胰酶消化，1ml完全培养基终止消化，1000rpm，离心5min；离心后弃上清并加1ml培养基制成单细胞悬液；取10µl胎盼蓝及10µl细胞悬液计数，计数后用培养基调整细胞浓度为1×103/100µl（3为上标）；7个96孔板中每孔接种1×103个细胞，培养基补足100µl，每个孔均设六个平行复孔，过夜至细胞单层铺满孔底，接种当天记为零天，温箱孵育，隔天换液；测定前4h，每孔加入20µlMTT溶液，温箱孵育4h；4h后超净台弃每孔培养液，加入150µlDMSO置摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解；30min内在酶标仪中检测490nm处各孔吸光值，连续检测五天。该实验独立重复三次。1.4.Transwell体外侵袭实验：用50mg/LMatrigel胶1：8稀释包被Transwell小室的上室，37℃烘干30min至胶凝固；细胞消化离心后用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为1~10×105个，向Transwell上室每孔加入200µl细胞，24孔板的下室加入500µl10%FBS的培养基；常规培养细胞12~24h，依据镜下观察侵袭情况结束培养时间；侵袭结束后用0.1%结晶紫染色，PBS清洗两次，每组设3个平行样本，每张膜由正中水平线及垂直线分为四个象限，选取象限及膜中心的5个高倍视野计数穿膜细胞数。实验独立重复三次。1.5.划痕修复实验：Marker笔在6孔板背后每隔0.5~1cm划线，每孔5条线；细胞制成单细胞悬液后接种到六孔板中，每孔约接种1×106个，接种后常规培养，掌握为过夜细胞能铺满孔底；第二天，用0.5~10µl枪头垂直于孔底背后Marker做划痕，注意枪头要保持垂直；划痕后用PBS清洗三次，加入无血清培养基常规培养；分别在划痕后的0、6、12、24小时为细胞拍摄照片，每组设三个平行样本，目测微尺测量划痕宽度并计算划痕修复率，每个样本观察两个视野（划痕修复率=（[0小时划痕宽度-各小时划痕宽度]/0小时划痕宽度）×100%，实验独立重复三次。1.6.Wesernblot检测人肺癌细胞系中的LASS2/TMSG-1蛋白的表达：两种不同转移潜能人肺癌细胞的培养，细胞裂解提取总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，电转移，蛋白免疫印迹反应，最后应用ChemiDoxXRS图像分析系统观察并照相，蛋白表达量用OD值来表示。1.7.RT-PCR方法反应检测95C与95D的LASS2/TMSG-1的mRNA表达水平，GADPH及TMSG-1的引物经GeneBank检索，利用Primer5.0软件设计，由北京奥科生物公司合成，TMSG-1引物序列为：上游，5'-TCCTGCCTTCTTTGGCTATTACTT-3'；下游，5'-TGCGTTCATCTTCTACCAGCTTTC-3'，扩增片段长度约为134bp。GADPH引物序列为：上游，5'-GAAGGTGAAGGTCGGAgTC-3'；下游，5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，扩增片段长度约234bp。95℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物于凝胶成像系统分析仪下下观察并照相。1.8.统计学处理：计量资料以X±S表示，应用SPSS19.0统计软件对数据进行t检验，比较LA