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1RT-PCR测定人胰腺癌干细胞Oct4和Nanog基因表达陈锦鹏王志伟陆玉华陆俊杰钱海鑫*【摘要】目的研究胚胎干性相关基因Oct4和Nanog在人胰腺癌肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞中表达的差异。方法流式细胞仪，在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选CD44+CD24+及CD44+CD24+ESA+肿瘤干细胞，用RT-PCR法、荧光定量PCR法测定其Oct4、Nanog基因的表达情况。结果Oct4及Nanog基因在CD44+CD24+ESA+细胞中及CD44+CD24+细胞中表达均高于Panc-1细胞。结论1.干细胞相关基因Oct4、Nanog在胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞中的表达高于普通胰腺癌细胞，并且其表达量与干细胞纯度成正相关。关键词：胰腺癌，肿瘤干细胞，Nanog，Oct4【Abstract】ObjectiveTostudyandcomparisonthegeneexpressionofOct4andNanogthatrelatedtoembryonicstemcellinhumanpancreaticcancerstemcell.MethodsIsolatepancreaticcancerstemcellsofCD44+CD24+andCD44+CD24+ESA+phenotypesbyaFACSAriaIIinhumancelllinePanc-1.DetecttheexpressionofOct4andNanoggeneinPanc-1cellandtwokindsofcancerstemcell-likecellsbyRT-PCR,Q-PCR.ResultsOct4andNanoggeneshaveahigherexpressioninCD44+CD24+ESA+cellsandCD44+CD24+cellsthanPanc-1cells..Conclusions1.Oct4andNanoggeneperformahigherexpressioninpancreaticcancerstemcellthaninPanc-1cell.Theexpresslevelispositivecorrelatedwiththepurityofcancerstemcell.KeywordsPancreaticcancer，Cancerstemcell，Oct4，Nanog[基金项目]国家自然科学基金资助课题（81101615）江苏省自然科学基金（BK2010276）[作者单位]陈锦鹏南通大学附属医院苏州大学医学院博士研究生[通信作者]钱海鑫苏州大学附属第一医院2胰腺癌在癌症致死病因中排在第四至第五位，其五年生存率不足5%，中位生存期仅6个月[1]。胰腺癌最让人头疼的问题之一是他对传统治疗手段普遍耐受[2,3]，很多研究发现，在接受传统放化疗之后胰腺癌开始变得耐药，使预后变差[4]。目前人们对胰腺癌的传统治疗无法改变这一现状，而基于胰腺癌手术标本和细胞系的基因表型和蛋白表达方面的研究[5]也未取得令人满意的结果。研究者们在不断尝试着胰腺癌治疗的新方法，他们希望通过胰腺癌干细胞的研究，发现干细胞特有的标记物，从而特异性的杀灭肿瘤干细胞。一系列的研究将矛头指向了可能存在并发挥关键作用的胰腺癌干细胞，胰腺癌干细胞属于肿瘤干细胞(CancerStemCell,CSC)，他们能自我更新和多向分化，并且还有强大的侵袭、转移和耐药的能力。本研究旨在探索并阐明胰腺癌肝细胞的生物学特性，为胰腺癌的治疗打开新的思路。1.材料与方法1.1主要材料人胰腺癌细胞系Panc-1（ATCC来源）购自上海中科院细胞库。DMEN高糖培养基、DMEM/F12培养基购自Hyclone公司，成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）购自Prospec公司，Trizol总RNA提取试剂、逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，PCR试剂盒购自Fermentas公司，FaststartSYBRGreenMasterROX购自Roche公司，PCR引物设计及合成由苏州睿安生物科技公司完成，微量RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，抗人CD44-APC、CD24-PE、ESA-FITC流式荧光抗体购自BD公司，羊抗兔FITC二抗购自Jackson公司,流式细胞分选仪(FACSAriaII)购自BD公司，荧光定量PCR仪7500购自ABI公司。1.2实验流程与方法1.2.1人胰腺癌细胞的培养和胰腺癌干细胞的获得将人胰腺癌细胞株Panc-1细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基、青霉素(1×105U／L)和链霉素(100mg／L)组成的培养基中，5％CO2，饱和湿度，恒温37℃培养，达到对数生长期后，用0.25％胰酶消化，完培重悬，离心弃去上清后，PBS液重悬细胞并计数。每1×106个细胞分别加入20μL抗人CD24-PE、抗人CD44-APC和抗人ESA-FITC抗体，室温避光孵育30min。对照组不加抗体。应用流式细胞仪进行检测及分选。每次细胞分选后重复上机一次，保证分选后的干细胞纯度95％。将分选得到CD24+CD44+双阳性细胞和CD24+CD44+ESA+三阳性细胞，分别种于无血清细胞培养基中（DMEM/F12培养基+10ng/mL成纤维细胞生长因子+20ng/mL上皮生长因子+ITS+1×105u/L青霉素+100mg/L链霉素），培养在5％CO2，饱和湿度，恒温37℃培养箱内。31.2.2RT-PCR检测Oct4、Nanog基因的表达用TrizolReagent分别提取未分选的PANC-1细胞、CD44+CD24+双细胞和CD24+CD44+ESA+三阳性细胞总RNA。将总RNA稀释成1μg/μL，取约5μg总RNA，加入1μldNTP混合液、1μgOligodT、DEPC水补足至12μl，65℃2min。混匀后冰上冷却，离心，加入4μl5x逆转录酶缓冲液、2μlDTT、1μlRNA酶抑制剂，混匀后37℃2min。室温加入1μlM-MLV逆转录酶混匀37℃50min逆转录为cDNA。70℃15min热灭活逆转录酶后，-20℃保存备用。PCR反应采用Fermentas试剂盒，25μl反应体系，dNTP2.5μl，包括10xTaq缓冲液2.5μl，引物F+R（10mM）1μl，Mgcl22μl，cDNA模板0.5μl，Taq酶0.125μl，双蒸水补足至25μul。用BIO-RADMycyclerPCR仪进行反应。94℃5min预变性后，进入PCR循环。94℃30s变性，60℃30s退火，72℃30s延伸，反应进行35个循环。取5μlPCR产物，混入1μl6x上样缓冲液，凝胶电泳，150V，30min后取出凝胶，在凝胶成像系统中观察电泳结果。Oct4、Nanog基因的表达定量采用荧光PCR测定。总RNA提取和逆转录过程同前。采用Roche试剂盒，20μl反应体系，包括ROX10μl，引物F+R（10mM）共1.2μl，cDNA模板1μl，双蒸水补足至20μl。用ABI7500荧光定量PCR仪进行反应。90℃，预变性10min，95℃10s，60℃31s，反应进行40个循环。PCR引物序列2.结果2.1胰腺癌细胞的培养和干细胞的获得普通胰腺癌Panc-1细胞在含10%FBS的完培中呈梭形，贴壁生长，增殖较快，约2-3天传代（见图1）。分选出的CD24+CD44+细胞和CD24+CD44+ESA+细胞在含有生长因子的无血清培养基中均为悬浮，呈球状生长，增殖速度较慢（见图2、图3)。以CD24、CD44为标记物，在人胰腺癌Panc-1细胞中分选CSC，阳性的细胞比例在1%-3%之间，以CD24、CD44、ESA为标记物，在人胰腺癌Panc-1细胞中分选CSC，阳性细胞比例在0.1%-0.8%之间。基因名称基因编号引物序列产物长度Oct4NM_002701.4F：5'-ATTCAGCCAAACGACCATCT-3'193bpR：5'-TCTCACTCGGTTCTCGATACTG-3'NanogNM_024865.2F：5'-AAGAACTCTCCAACATCCTGAAC-3'129bpR：5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3'GAPDHNM_002046.3F：5'-CTCCTCCACCTTTGACGCT-3'187bpR：5'-GGGTCTCTCTCTTCCTCTTGTG-3'4图1胰腺癌Panc-1细胞（200x）图2CD44+CD24+细胞（200x）图3胰腺癌CD44+CD24+ESA+在无血清培养基中生长（200x）2.2PCR检测Oct4和Nanog基因的表达采用RT-PCR观察Oct4和NanogmRNA表达变化，以GAPDH作为内参，PCR产物经电泳鉴定，条带位置与预期扩增长度相符。结果发现Oct4和Nanog在分选的双阳性细胞和三阳性细胞中表达均升高。见图4图4RT-PCR检测Oct4和Nanog的表达，三阳性（+++）、双阳性（++）、未分选（un）用2–ΔΔCT法分析实验数据，计算各组细胞相关基因表达的相对差异，以GAPDH5作为内参基因。分析统计结果可见Oct4基因的表达，双阳性组较未分选组升高2.936±0.318倍，三阳性组较未分选组表达升高8.141±1.378倍。Nanog基因的表达双阳性组较未分选组升高5.109±0.923倍，三阳性组较未分选组表达升高7.945±0.652倍。将各组ΔCT值进行方差分析及假设检验，结果P0.05，差异有统计学意义，两种基因在三阳性组的表达均高于双阳性组。见图50123456789Oct--4Nanog三阳性双阳性图5荧光定量PCR检测三阳性、双阳性细胞相对未分选细胞Oct4、Nanog基因表达倍数，以2-△△Ct计算倍数差异（参考内参GAPDH的表达）（p0.05）3.讨论肿瘤干细胞的研究，是当今的科研热点。国内外学者相继报道，已从多种恶性肿瘤中分离出干细胞，而基于肿瘤干细胞理论的胰腺癌研究则刚刚处于起步阶段。在2007年Li[6]等人首次成功的分离出了胰腺癌CSC，他们发现以CD44+CD24+ESA+为表面标记的胰腺癌细胞数量仅占胰腺癌细胞的0.2-0.8%，但其形成转移瘤的效率确是普通肿瘤细胞的100倍以上，只需要注入100个细胞就可以使NOD／SCID小鼠成瘤。2008年黄鹏[7]等以CD44+CD24+为标记分选胰腺癌干细胞，并对肿瘤干细胞生物学行为方面的研究，证实了Li等人的观点，认为以这种表面标记分选出的肿瘤干细胞具有缓慢生长，高致瘤能力的肿瘤干细胞特征。Oct4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，它能够促使ICM形成、维持ESC未分化状态并促进其增殖[8]。因此，Oct4对于胚胎干细胞干性的建立是至关重要的。Nanog因子作为一种同源结构蛋白在多潜能ESC和胚胎生殖细胞中表达，当细胞发生分化时表达下调。Nanog蛋白质在细胞获得全能性的一系列复杂过程中发挥着非常关键的作用，协调着一系列基因和蛋白质在各自正确的位置上发挥作用，如果没有它，胚胎干细胞将不会发育，6而诱导多功能肝细胞的过程中也会失败，因此Nanog被称为胚胎具有发育成各种类型细胞能力的“总开关”[9]。2008年国内学者直接以Oct4基因作为标记，通过流式细胞仪分选出肿瘤干细胞，然后通过RNA干扰的方法，沉默肿瘤干细胞中Oct4基因的表达，使肿瘤细胞凋亡，抑制了肿瘤生长[10]。本研究通过流式细胞仪分选出CD44+CD24+细胞和CD44+CD24+ESA+细胞，其无血清培养基中呈干细胞球样生长，这与文献报道的CSC的干细胞样特征相符合，说明胰腺癌干细胞的确存在。通过RT-PCR及荧光定量PCR检测，我们发现Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+细胞要高于CD44+CD24+细胞中的表达，其在CD44+CD24+细胞中较未分选细胞高表达，用2–ΔΔCT法分析实验数据发现其表达差异具有统计学意义。这种正相关趋势，提示了：一，CD44+CD