人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞

中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·董金辉，男，1975年生，内蒙古自治区人，汉族，2010河北医科大学毕业，硕士，主治医师。通讯作者：董金辉，河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北省石家庄市050000中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)32-04764-07稿件接受：2016-06-01人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞董金辉，任秀敏，徐鸥，王建星(河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北省石家庄市050000)引用本文：董金辉，任秀敏，徐鸥，王建星.人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4764-4770.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.008ORCID:0000-0002-7736-0966(董金辉)文章快速阅读：文题释义：脐血干细胞：其具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。同时，脐血具有淋巴细胞抗原性弱、功能相对不成熟、移植后发生移植物抗宿主病的风险较低等特点，并且来源广，不受伦理和道德的限制，因此是干细胞移植的重要来源之一，具有广泛应用于临床组织工程学的巨大潜能。鼻黏膜纤毛上皮细胞：其与外界环境想通，属于不稳定细胞，受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。临床上常采用鼻内窥镜手术进行长期、定时随访观察鼻腔内容物，防止鼻腔黏膜粘连和炎症复发。术后使用黏液促排剂及其他局部生物材料来改善鼻黏膜的修复，但是由于随访时间不易控，时间长达数月也不能完全治愈，不但给患者带来了沉重的经济负担，而且也严重影响了患者的生活质量。摘要背景：鼻黏膜纤毛上皮细胞受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。相对于其他成体干细胞，人脐血干细胞具有更好的诱导分化潜能。目的：观察人脐血干细胞通过体外培养、诱导分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的可行性。方法：收集正常健康人脐血，分离人脐血干细胞，通过体外培养，鉴定干细胞表面标记物后进行传代培养；取第3代脐血干细胞，用携带增强型绿色荧光蛋白重组腺相关病毒进行感染，采用气液界面培养法，分别于诱导感染1，2周后对干细胞进行MUC8基因PCR检测。在脐血干细胞培养3周后进行FOXJ1免疫荧光染色。结果与结论：①培养鉴定结果：原代人脐血干细胞传代至第3代时，细胞形态较均一，折光性良好，可表达干细胞表面标记物；②转染鉴定结果：细胞转染3h后，可见第3代干细胞呈现出绿色荧光，培养48h后，流式细胞仪检测细胞阳性率达96.2%，说明干细胞转染效果很好；③RT-PCR检测：人脐血干细胞MUC8mRNA无表达，而鼻黏膜上皮细胞MUC8mRNA呈现出强表达，培养1周时MUC8mRNA呈现弱表达，培养2周后有一定的增强；④免疫荧光染色：在转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到FOXJ1红色荧光呈现阳性表达结果；⑤结果说明：人脐血干细胞在适宜培养条件下可分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞。关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；鼻黏膜上皮细胞；人脐血干细胞；气液界面培养法；分化；鼻黏膜纤毛上皮细胞；MUC8；FOXJ1；鼻窦炎主题词：干细胞；组织工程；鼻窦炎基金资助：2014年度河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140002)人脐血干细胞通过体外培养、诱导分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的可行性人脐血干细胞鼻黏膜纤毛上皮细胞气液界面培养法诱导分化董金辉，等.人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4765:DongJin-hui,DepartmentofOtolaryngology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,HebeiProvince,ChinaHumanumbilicalcordbloodstemcellsdifferentiateintonasalciliatedepithelialcellsDongJin-hui,RenXiu-min,XuOu,WangJian-xing(DepartmentofOtolaryngology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Damagetonasalciliatedepithelialcellscanleadtoasevereinjuryinnasalbiologicalfunction.Comparedwithotheradultstemcells,humanumbilicalcordbloodstemcellshavebetterdifferentiationpotential.OBJECTIVE:Toexplorethefeasibilityofhumanumbilicalcordbloodstemcellsdifferentiatingintonasalciliatedepithelialcellsthroughinvitrocultureandinductiontechniques.METHODS:Normalandhealthyumbilicalcordbloodsampleswerecollectedtoisolatehumanumbilicalcordbloodstemcells,followedbyidentificationandsubcultureinvitro.Umbilicalcordbloodstemcellsatpassage3wereinfectedwithrecombinantadeno-associatedviruscarryingenhancedgreenfluorescentproteinandculturedusingairliquidinterfaceculturemethod.Thereafter,PCRassaywasemployedfordetectingMUCSexpressioninculturedstemcellsat1and2weeksafterinduction,andimmunofluorescentstainingforFOXJ1wasperformedat3weeks.RESULTSANDCONCLUSION:Aftersubculture,passage3umbilicalcordbloodstemcellsthatcouldexpressstemcellsurfacemarkerswerevisibleinauniformshapeandhadgoodrefraction.After3hoursofgenetransfection,greenfluorescenceissuedfromthepassage3cellswerevisible,andthecellpositiveratewasupto96.2%until48hours,indicatinggoodtransfectionefficiency.RT-PCRfindingsshowedthatMUC8mRNAhadnoexpressionintheumbilicalcordbloodstemcells,butexpressedstronglyinthenasalciliatedepithelialcells,whoseexpressionwasweakat1weekofcultureandincreasedat2weeks.Additionally,thepositiveexpressionofFOXJ1redfluorescencewasobservedunderthetransfectionofgreenfluorescentprotein.Theseresultssuggestthathumanumbilicalcordbloodstemcellscoulddifferentiateintonasalepithelialcellsundersuitableconditions.Subjectheadings:StemCells;TissueEngineering;SinusitisFunding:theMedicalResearchProjectofHebeiProvinceofChinain2014,No.ZL20140002Citethisarticle:DongJH,RenXM,XuO,WangJX.Humanumbilicalcordbloodstemcellsdifferentiateintonasalciliatedepithelialcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4764-4770.0引言Introduction慢性鼻-鼻窦炎是临床上常见的慢性疾病，病程甚至长达数月[1]。慢性鼻-鼻窦炎长期迁延不愈会有并发症发生，有些并发症发生甚至会有生命危险，还能显著降低患者生活水平[2-3]，目前对其发病原因及发病机制还未完全清楚[5-8]。鼻黏膜纤毛上皮细胞与外界环境想通，属于不稳定细胞，受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。临床上常采用鼻内窥镜检查进行长期、定时随访观察鼻腔内容物，防止鼻腔黏膜粘连和炎症复发。术后使用类固醇喷雾、黏液促排剂及其他局部生物材料来改善鼻黏膜的修复，但是由于随访时间不易控，时间长达数月也不能完全治愈，不但给患者带来了沉重的经济负担，而且也严重影响了患者的生活质量。因此，寻找一种可以使病变黏膜重新恢复正常的替代物是目前科学家关注的重点。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其在体外适当诱发环境下可以分化为多种细胞，并具备组织的生物功能。近期文献报道表明，体外人工分离、培养干细胞，并通过移植技术治疗恶性肿瘤等慢性疾病已取得一定成效[9-13]。目前用于研究的干细胞包括间充质干细胞、造血干细胞及脂肪源性干细胞等[14-22]。人脐血干细胞是从人脐带中分离获得，获取过程不违背伦理，含量高，免疫原性低，增殖能力强。相对于其他成体干细胞来说，人脐血干细胞显得更加的“年轻”，具有更好的诱导分化潜能，是宝贵的细胞来源。Kogler等[23]认为脐血间充质干细胞可以分化为3个胚层的不同细胞。有研究将人脐血间充质干细胞与损伤小气道上皮细胞联合培养后，一些间充质干细胞迅速分化为上皮样细胞，修复单层上皮，并表达许多正常小气道上皮细胞的基因特点[24]。有研究观察人脐血干细胞蛛网膜下腔移植治疗中枢神经系统损伤患者在体内向神经干细胞(NSCs)分化的状态[25]。因此，实验通过分离、纯化人脐血干细胞，采用气液界面培养法培养人脐血干细胞及人鼻黏膜上皮细胞，观察细胞形态学，诱导分化成纤毛细胞的可能性，对研究人脐血干细胞向鼻黏膜纤毛上皮细胞的分化具有重董金辉，等.人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞P.O.Box10002,Shenyang110180要意义。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外实验。1.2时间及地点于2015年3至12月在河