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1、什么是定量PCR？以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。2、定量PCR定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y=X(1+E)n，其中E代表扩增效率：E=参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（30次），E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。PCR扩增通式：①Tn=T0（1+E）n②Tn=Tn-1（1+E）n注：[0其中E表示扩增效率，n为循环数，Tn表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量，T0为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossingpoint）,也就是K=T0（1+E）CP，取对数即：lgK=lgT0+CP*lg(1+E)CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lgT0）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为-1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果，如下图所示。另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2,N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1,E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32;E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分为四种类型：①直接定量检测法，②同位素标记定量，③酶标记定量检测法，④荧光定量PCR技术荧光定量PCR主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光大增强。因此，SYBRGreenI的检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI的缺点：由于SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。5、为什么要用荧光定量PCR技术进行定量？它与传统的定量PCR有什么不同？如前所述的，传统的定量PCR有很多，主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA法，但这些定量PCR技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测。（3）大多数是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（如下图所示），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量；虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以传统定量PCR的缺点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。而荧光定量PCR有如下显著的优点：1、特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。2、灵敏度高，荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。3、线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0－1010拷贝/毫升。4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。5、速度快、高通量，可在2－3小时完成96个样品的定量分析。6、荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？A、内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。B、荧光定量PCR无需内标定量实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。7、为什么要用定量PCR而不是定性PCR？在实验生物学及临床医学的一些场合，由单纯PCR所提供的阳性或阴性结果还远远不够，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的定量起着至关重要的作用。定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。与非定量PCR分析方法不同，定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使负对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。8、如何设计荧光定量PCR实验方案？1)、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列。（）2)、用引物设计软件Primer5.0、Oligo6.0或beacondesigns3.0进行引物探针的设计；（该软件可在下载）引物设计通常遵守如下原则：A、引物与模板的序列要紧密互补。B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免出现3个以上连续相同的碱基。F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。探针设计通常遵守如下原则：A、探针位置尽可能地靠近上游引物。B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC含量在40%－70%。C、探针的5’端应避免使用碱基G。D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。3）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。()4）、根据仪器特点和个人的喜好，选择标记的荧光素种类。如：FAM、Texasred、LC-Red640，LC-Red705等，同时确定荧光定量PCR的方法，选择Taqman或beacon等，可参考前面所述。5）、选择高品质的引物探针合成商，如闪晶生物等。6）、外标准品的制备：一种是化学合成目的基因，它的优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成120bp以下的长度；一种是将PCR扩增产物直接梯度稀释，它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定；另一种是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，它的优点是稳定、准确。如果是转基因食品，则要求转基因食品与非转基因食品按一定的比例混合做成标准品。稀释液可以是TE或者是闪晶生物提供的DNA保存液。拷贝数＝（质量÷分子量）×6.0×1023。通常外标由4个点到5个点组成，模板的浓度分别为107/ml、106/ml、105/ml、104/ml、103/ml。7）、合成好的引物探针，最好用双蒸水稀释成25pmol/ul的浓度，然后放－20℃保存，还应该注意避光保存探针。如果是配成25pmol/ul的浓度，那么所加水的量是（ul）：(OD数×33)÷分子量×400008)、PCR反应液的配制1×PCRbuffer、0.3-0.5pmol/ul的引物、0.1－0.3pmol/ul的探针、2.5-4.0mM的Mg2+、1-2U的Taq酶、0.2－0.4mM的dNTPs、0.2-1U的UNG酶、0.3-0.6mMdUTP、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul（以上所有的浓