保健食品的微生物限度检验方法验证浅析

保健食品的微生物限度检验方法验证浅析引言随着国民生活水平的提高，人们对生活的质量也有了较高的要求，防病于未然的健康意识逐渐被人们所重视，保健食品随之成为人们脱离亚健康的途径之一。我国的保健食品概念是1996年《保健食品管理办法》中的“标明具有特定保健功能的食品。即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的的食品”。具有三种属性：食品属性；功能属性(具有特定的功能)；非药品属性。然而劣质的保健食品不仅不能提高人们的生活质量，甚至威胁生命安全，因而保健食品的安全评价及质量检验是保证人们使用合格产品的前提。保健食品的质量安全包括两方面内容：不以传统食品为载体的保健食品具有其特有的安全问题。以传统食品为载体的，要考虑相应的食品安全问题，如以植物为来源的传统食品当考虑农残、植物生长刺激素等；以动物为来源则应考虑抗生素、激素等。但同时作为保健食品特有的质量安全问题，还须高度关注保健食品中加入化学药物（如违法添加芬氟拉明、麻黄素或速尿的减肥产品；又如某些“补品”检出了枸橼酸西地那非，即伟哥的主成分），各种功效成份/提取物内源性毒物安全（如中草药毒性及长期服用安全性评价），新资源、新技术、功能性安全，进口保健食品，伪劣保健食品，非法添加物的检验等问题。鉴于保健食品于近年来暴露出的一些质量问题，中检所和药检处统一部署，扩大我所检验范围，开展对保健食品的质量监督检验工作，微生物限度作为食品药品的必检项目，显示其基础安全的重要性。我室于2005、06年进行了保健食品卫生微生物学限度检验及方法学验证实验工作，完成了30多种购买样品的试检验任务，以及几个注册品种的检验，涉及口服液、片剂、胶囊、茶剂等常见保健食品类型，结合食品国标和药典探讨保健食品的检验方法及可行性，现对有检验情况汇报如下，供检验部门参考。摘要我所按中国药典2005版微生物限度法及方法学验证法，对32种保健食品进行方法学验证，结果表明其中15个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神牌轻亮、养颜鹿胎粉、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、二月红牌红润片）分别对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。结果说明：1、采用GB/T4789.1~4789.31~2003食品微生物限度检查法不能真实反应产品质量，因而不宜采用；2、应分别采用培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。3、微生物限度方法学验证的必要性。关键词方法学验证、微生物限度、回收率、保健食品质量。一、实验目的确认对保健品进行微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该保健品的微生物限度检查。样品（1）天元甘露低聚果糖液20040701云南绿色生物工程有限公司（2）维生素E（加州熊）040902济南生命力生物科技有限公司（3）海王金樽040712深圳市海王健康科技发展有限公司（4）神奇寿乐牌排铅冲剂040210常州市红太阳工程有限公司（5）盖中盖高钙片20041207哈药集团制药六厂（6）龙希膳食纤维胶囊20030718湖北恩施宏业魔芋开发有限责任公司（7）紫薇卵磷脂胶囊20041119清华紫光（集团）总公司（8）吾老七羊胎美容浓缩液04092701浙江蘅州市吾老七保健品有限公司（9）脑轻松胶囊20041207香港康富来国际企业有限公司（10）江中亮嗓胖大海20040822云南绿生物工程有限公司（11）江中活谓素得而乐胶囊20041206广州蓝钥匙海洋生物工程有限公司（12）忘不了3A脑营养20041107山东禹王制药有限公司（13）瞳神牌轻亮04030101北京轻尔特科技开发中心（14）再高铁儿童成长胶囊20040920广州市红虹生物科技有限公司（15）血尔口服液20040006香港康富来国际企业有限公司（16）金舒通胶囊20040601-05武汉名实医药科技有限责任公司（17）仙牌灵芝茶20050112四川仙牌灵芝集团有限公司（18）事轻松胶囊20041026武汉静悟绿色保健研究所（19）养颜鹿胎粉040606广东广济堂医药保健品有限公司（20）老君舒压茶20041218成都物华生物制品有限公司（21）梦玉胶囊20050102济南生命生物科技有限公司（22）心态好（天一美乐宁片）031201北京乐宁科技有限责任公司（23）华济堂牌护肝灵胶囊20060517美国德全高科技药业2006052120060525（24）前烈立舒胶囊QLS05222香港奥美制药厂（25）二月红牌红润片2007042425050中天(上海)营养食品有限公司（26）绅宁宝胶囊20050220、20050225香港康恩堂制药有限公司（27）博士伦博视康牌叶黄素片1515、1525、1535德国博士曼大药厂（28）全虫草胶囊2006210西藏天知生物科技开发有限公司（29）觉父胶囊20050307、20050327香港奥美制药厂（30）苦瓜精华素片3117、3500美国GSL科技有限公司（31）宁烈宁胶囊20050428、20050509香港奥美制药厂（32）富威牌剑影胶囊021333北京富威生物科技开发公司二、培养基胆盐乳糖增菌液批号：040324玫瑰红钠琼脂批号：050316营养琼脂批号：050310营养肉汤批号：041010改良马丁琼脂批号：050520改良马丁琼脂液体批号：040302曙红亚甲蓝琼脂批号：040413葡萄糖肉浸液肉汤批号：040902EMB批号：040413麦康凯批号：050608血营养琼脂批号：050310沙门、志贺菌属琼脂批号：050121胰酪胨大豆肉汤批号：050422DHL批号：0501274-甲基伞形酮葡萄糖苷(MUG)050127GN批号：040224四硫酸钠煌绿增菌液TTB批号：040413以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供，另由本室本室自行配制胆盐乳糖增菌液（小倒管）10ml。三、菌种枯草杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(F)44102]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）[CMCC(F)51573]乙型溶血性链球菌（β－Hemolyticstreptococcus）[CMCC(F)32210]沙门氏菌（Salmonellaparatyphi）[CMCC(B)50094]四、方法验证1、菌液制备：（1）取经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾肉汤培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5~10-7为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（2）取经25℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（3）取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1ml+9ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50~100CFU/ml，做活菌计数备用。菌液的检验（1）取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、乙型溶血型链球菌、福氏痢疾菌、沙门菌10-5~10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48小时，计数，应约为50~100cfu/ml。（2）取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml，用45℃琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养,逐日观察计数，应约为50~100cfu/ml。供试液制备称取样品10g，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液100ml浓度均为1：10供试液。细菌、酵母菌及霉菌的方法学验证（1）常规法：采用加1：10供试液1ml，分别人工接种上述5种阳性代表试验菌株，50~100CFU/ml，再加15~20ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率结果见表2。（2）培养基稀释法：采用加0.5ml、0.2ml、0.1ml/皿供试液，人工接种上述敏感试验菌株，再加15~20ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。结果见表3。（3）薄膜过滤法：分别取不同品种的1：10供试液取上清夜1ml加入滤器中、用0.1%蛋白胨氯化钠稀释液冲洗300ml/滤器再加规定敏感菌株冲洗后、取出滤膜贴规定培养基培养24~72小时观察结果见表4。回收率测定：（1）试验组：分别取不同品种的1：10供试液1ml、50~100CFU/ml试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌。（2）活菌组：测定每一菌株加的试验菌数见表1（3）供试液对照：测定供试品本底菌数（略）（4）稀释剂对照组。回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率：％菌液组的平均菌落数落数供试品对照组的平均菌试验组的平均菌落数试验组的加菌回收率＝100（三）、控制菌检查方法学验证当建立药品的微生物检查法时，应进行控制菌的方法学验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查（1）试验组取1：10供试液，接入100ml/瓶5瓶胆盐乳糖增菌培养基和3瓶亚碲酸盐肉汤增菌培养基中，（10ml供试液/瓶）其中1瓶接种大肠埃希菌、福氏痢疾、沙门菌供试液瓶、稀释剂对照组瓶；其中1瓶接种乙型溶血性链球菌、供试液瓶、置35培养经24~48小时结果见表5。（2）阴性菌对照组a取金黄色葡萄球菌50~100cfu/ml，接种胆盐乳糖增菌培养基中，置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。b取大肠埃希菌50~100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。五、结果菌落计数表1菌落计数实验次数金葡菌10-6枯草杆菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大肠杆菌10-6126、2617、1336、35128、129134、151283、8616、2526、2494、9839、44378、8698、96100、110120、12660、62469、49100、102100、110128、13025、20表2微生物限度检查法验证常规法接种阳性菌株的回收率（%）序号供试品金葡菌枯草杆菌大肠杆菌白色念珠菌黑曲霉菌1天元甘露低聚果糖液100.080.0100.094.2100.02维生素E（加州熊）97.070.795.2100.0100.03海王金樽100.070.775.9100.090.64神奇寿乐牌排铅冲剂98.895.187.9100.0100.05盖中盖高钙片100.0100.087.799.187.46龙希膳食纤维胶囊100.0100.0100.094.282.97紫薇卵磷脂胶囊100.0100.0100.0100.095.48吾老七羊胎美容浓缩液100.0100.0100.087.6100.09脑轻松胶囊100.0100.0100.079.1100.010江中亮嗓胖大海100.0100.073.896.5100.011活谓素得而乐胶囊55.1100.0100.085.2100.012忘不了3A脑营养0.0100.093.373.3100.013瞳神牌轻亮88.80.090.4100.0100.014再高铁童少儿成长口服液100.046.381.9100.01