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沉淀反应信阳职业技术学院药学与检验系沉淀反应沉淀反应——是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。第一节液相沉淀反应液相沉淀试验是指可溶性抗原与相应的抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物的试验。类型：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度分析。一、絮状沉淀反应原理：将抗原抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原于抗体结合，形成絮状沉淀物。技术类型：1.抗原稀释法（Dean-Webb法）2.抗体稀释法（Ramon法）3.棋盘格法（Checkerboard法)二、环状沉淀试验原理：将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环。Ascoli1902年创立方法学评价：该方法操作简便、快速。敏感性低（3-20mg/L)，只能定性。主要用于鉴定微量抗原，如鉴定血迹，诊断炭疽。现在很少使用。第二节凝胶内的沉淀试验凝胶内沉淀试验是将可溶性抗原和相应抗体分别放入凝胶内进行扩散，两者在比例合适的位置形成肉眼可见的沉淀环或沉淀线。常见的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶。凝胶内的沉淀试验类型一、单向扩散试验1.试管法2.平板法二、双向扩散试验1.免疫电泳2.对流免疫电泳3.火箭免疫电泳4.免疫固定电泳一、单向扩散试验1.试管法1946年Oudin首次报道。将抗血清或纯化抗体混入约50oC的0.7%琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，带凝固后，在凝胶上面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。本法多用于排泄物和组织均匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测。沉淀线图16-12种抗血清形成的沉淀线示意图AgAb一、单向扩散试验二、平板法1.原理：待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。单向琼脂扩散试验上排为5个不同的参考血清，下排为待测血清2.技术要点：将抗体或抗血清混入0.9%的琼脂糖内，未凝固前倾注呈平板，凝固后在琼脂板上打孔（直径约3-5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37oC让其向四周扩散，24~48后可见孔周围出现沉淀环。3.数据处理1.Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散（48h)的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C/d2=K3.数据处理2.Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（24h)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与扩散圈的直径之间呈线性关系。公式表示：logC/d=K4.临床应用常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量测定。二、双向扩散试验1.原理：将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者在凝胶内自由扩散，当抗原与抗体相遇，浓度比例适当处形成可见的白色沉淀线。2.技术要点将加热融化的琼脂倾注一均匀的凝胶薄层，待琼脂凝固后，在琼脂胶板上打孔，在相对应的孔中分别加入抗原或抗体，置室温或37℃18-24小时，观察沉淀线。3.方法评价是抗原抗体鉴定的最基本的方法之一。本试验是一种稳定、简便的方法，不需要特殊仪器设备，重复性好，但灵敏度稍差（1.25mg/L)。4.临床应用1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估算出现沉淀线，表明存在相应的抗原和抗体，不出现沉淀线则表明抗原或抗体的缺乏。沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量较多。出现多条沉淀绒，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，双向免疫扩散可用于鉴定抗原或抗体的纯度。2．分析抗原或抗体的相对分子量抗原或抗体在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。分子量大扩散慢，扩散圈小，局部浓度则较大，因此形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如二者分子量相等，则形成直线（图16-5）。抗体多为IgG，分子量约150kD，据此可粗略估计未知抗原的分子量。3．用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。在一块琼脂板上打三个孔，二个孔中加入抗原，一个孔中加入抗体，扩散后通过沉淀线的形态可鉴定两种抗原的性质（图16-6）。这种技术作为抗原的分析，是免疫化学中较常用的鉴定技术之一。4．用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。第三节免疫电泳技术免疫电用技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：1.加快了沉淀反应的速度；2.将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，在分别与抗体反应，以此作更细微的分析。一、免疫电泳是区带电泳与免疫双扩散的结合。1953年Grabar和Williams首先报道。根据各蛋白所出的电泳位置，可分为白蛋白区、球蛋白a1区、a2区、b区、γ区。其基本原理是将蛋白质抗原在琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异，而被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。血浆蛋白各区带位置示意图根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准（或正常）抗原、抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。二、对流免疫电泳原理在琼脂板上打两排孔，左侧各孔加入待测抗原，右侧孔内放入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极侧，而抗体籍电渗作用流向阴极抗原侧，在二者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。—+三、火箭电泳RIE:又称为单向扩散免疫沉淀技术。操作：在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距2~3mA/cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。用途：抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原呈正比，用已知量标准佐对照，可以测定未知标本中的抗体含量。四、免疫固定电泳IFE：将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生反应，形成复合物嵌于固相支持物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白。区带电泳支持物选用滤纸、醋酸纤维薄膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆可。常用于M蛋白的鉴定。