从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定方惠祯（闽南师范大学生科院食品质量与安全14级1413110110）摘要：熟练分离纯化微生物的基本操作技术，并对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。关键词：细菌、霉菌、放线菌、培养基配制、高压蒸汽灭菌、干热灭菌、平板划线、斜面接种ISOLATEDFROMSOILMICROBIALANDPURETRAININGPRELIMINARYOBSERVATIONAPPRAISALEXPERIMENTREPORTFangHuizhen(FoodqualityandsafetyofFujianNormalUniversityacademy141413110110)Abstract:skilledpurificationmicrobialthebasicoperationofthetechnology,andthesoilofthemicrobialseparationandpurification,accordingtothecolonymorphologyobservationandaseriesofphysiologicalandbiochemicalresults,thecomparisonspeciesfeaturesofseparationandpurificationpreliminaryidentificationofmicrobialsubordinategroups.KeyWords:bacteria，mould，Actinomyces，Culturemediumpreparation，High-pressuresteamsterilization，Dryheatsterilization，Flatcrossed，Cantvaccination生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离纯化技术主要由采集样品、培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。1材料与方法1.1.培养基的配制1.1.1.细菌培养基的种类细菌、放线菌、酵母菌三类微生物培养基的配制1.1.2实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、氯霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4.3H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4.7H2O。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、枪头、移液枪、培养皿、棉花、接种环、记号笔、线绳、纱布。1.1.3培养基的配方（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15~20g、水1000ml、pH7.4~7.6。1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速，并及时把试剂瓶盖紧.2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。3、调pH用pH试纸或酸度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。（分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。）分装量：固体培养基约为试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。6、加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8、灭菌将上述培养基于121.3oC湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9、摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固。10、无菌检查将灭菌的培养基放入37oC温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g,K2HPO4.3H2O0.5g,FeSO4.7H2O0.01g,琼脂15~20g,水1000ml,pH7.4~7.6。1、称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的储备液后再加入,方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O,配成浓度为0.01g/mL的储备液,再在1000mL培养基中加入以上储备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2、pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼脂15~20g,水1000ml，自然pH1、称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3ml,混匀后,再加入琼脂加热融化,方法同(一).2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同（一）。3、氯霉素的加入氯霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化待温度降至45oC左右时才能加入。可先将氯霉素配成1%的溶液（配好的氯霉素溶液保存于-20oC），在100ml培养基中加入1%氯霉素0.3ml，使每毫升培养基中含氯霉素30μg。1.1.4土样取自闽南师范大学瑞京公寓芒果树，地下10cm~15cm1.2消毒和灭菌1.2.2高压蒸汽灭菌I自动立式压力蒸汽灭菌器的操作步骤I-1装料开盖，把包扎好的灭菌物品放在灭菌桶内的筛板上，灭菌包体积一般不超过20cmX10cmX10cm为宜，各包之间留有间隙，以利于蒸汽穿透。在堆放灭菌包时应注意安全阀、放汽阀孔位置必须留出空位，保障其畅通放汽，否则因安全阀出气孔堵塞不能工作造成事故。I-2开机I-2-1加水：接上本机标牌一致的电源，将控制面板上电源开关按至ON处，此时断水灯（黄色）亮，显示电源已正常输入。低水位灯（红色）亮，显示蒸发锅内处断水状态，然后将灭菌桶盖罩住灭菌桶，把生活用水从灭菌桶与蒸锅夹缝内加入，当水位达到高水位时，以上两灯同时灭。此时，应继续加水到高水位灯（绿色）亮时停止。I-2-2设定温度：数显窗内，红色数显为灭菌桶内温度，绿色数显为设定温度。按动控制板上增加键或减少键，可在绿色数显上设定所需温度，按动位移键可将闪烁的绿灯数显进位移位设定，当每次所需温度结束时，须按一下确认键进行确认，即可完成设定。此时，红色数显随着蒸发锅内温度上升而变化。I-2-3设定时间：温度设定完毕并按确认键后，绿色数显切换成定时状态，按位移键定位，然后再按增加键和减少键，设定所需的保温时间，设定完毕后，须按一下确认键进行确认。保温时间采用倒计时，当灭菌锅内温度达到设定温度时，定时器才开始计时。如在运行过程中要查看时间数和设定温度数，只要按一下确认键，便可切到所需的数显进行阅读。I-3密封：以上操作完成后，将压板完全推入固定柱内，将手轮向右旋紧，使盖与主体密封。I-4灭菌I-4-1排气：为了保证温控仪与灭菌室温度的一致，应将灭菌室内的冷空气排除干净，具体可在加热开始时打开放气阀，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气阀孔排出，一般认为，当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净（沸后约5min），然后关上排气阀。同时将下排气阀稍稍的打开，让微量的蒸汽通过下排气阀在整个灭菌过程中不断排出，这样有利于灭菌室上下部温度保持同步。I-4-2当设定时间结束时，电控装置自动关闭加热电源，并伴有蜂鸣提醒。此时，应将电源关闭。I-4-3灭菌结束后，待其冷却，直至压力表指针回复至0位后，打开排放气阀再待数分钟排去余汽，才能将盖打开，取出灭菌物品，排掉剩水。1.2.2干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、过滤器、移液管等的灭菌。使用的仪器为干热消毒箱。1、装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放入消毒箱中，关闭箱门。2、温度与时间的设定打开电源开关，在控制面板上对温度和时间进行设定，本实验所需温度为160~170oC，当温度上升到所设定的温度后，计时开始，一般设定时间为2h。3、灭菌过程当温度上升到设定的温度后，维持所需（设定）时间，设定时间一结束，数显示窗显示“End”，加温电源切断，并有声音提醒，关闭电源。4、取出灭菌物品待消毒箱温度降到70oC以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。1.3土壤微生物的稀释分离纯化、无菌操作技术、微生物菌落的观察及初步鉴定1.3.1土壤稀释分离1、取土壤取表层以下5~10cm处的土壤样品，放入灭菌的袋中备用，或放在4oC冰箱暂存。2、制备稀释液（要无菌操作）（1）制备土壤悬液：取土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），振荡5~10min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬液。（2）稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL,放入4.5mL无菌水中,即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3~10-7的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。示意图如下：0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml10-210-310-410-510-610-7稀释过程示意图（图中左侧梯形为三角瓶，其中加入49.5ml无菌水与0.5g土样，土壤溶液稀释度为10-2依此类推，右侧三试管中土壤稀释度分别为：10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）3、混菌法测定菌落数的方法（1）细菌：在洁净工作台内，取10-7、10-6两管稀释液各1ml,分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度做两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板，倒平板时要注意无菌操作，倒平板的方法见