仔猪大肠杆菌基因工程疫苗

仔猪大肠杆菌病基因工程灭活疫苗（K88ac-ST1-LTB）新生仔猪大肠杆菌病是由产肠毒素性大肠埃希氏菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)引起的一种高度接触性、急性、致死性腹泻，特征是排黄色或黄白色稀粪。临床上以1～7日龄新生仔猪下痢为主要特征，其中1—3日龄最多见。个别耐过仔猪经较长时间才能正常生长，但病愈存活后其生长发育和生产性能指标受到严重影响。大肠杆菌性腹泻在我国广泛流行，新生仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率在不同地区各有差异，发病率为5.69%～86.5%，死亡率为17.0%～73.0%。本病是影响养猪业发展的主要疾病之一。产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)有两类致病因子：一类为黏附素（或称定居因子，起吸附固定作用，主要分为K88、K99、987P、F41等，其中以K88为主。另一类为肠毒素(耐热性肠毒素ST和不耐热性肠毒素LT)，是直接导致腹泻的因子。细菌通过黏附素固定在肠黏膜表面，大量繁殖后产生ST与LT两种肠毒素，引起剧烈腹泻，脱水、酸中毒、低血钾等。辽宁益康生物股份有限公司科研人员经过大量的流行病学调查，病原菌的分离鉴定，致病因子的研究，从细菌致病机理出发，成功地研发出免疫谱宽，免疫效果好，使用安全的仔猪大肠杆菌基因工程疫苗，从根本上解决了新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题，现将有关情况报告如下。一、疫苗免疫机理妊娠母猪临产前进行大肠杆菌基因工程灭活疫苗免疫接种，产生三种抗体（抗ST1抗体、抗LT抗体、抗K88抗体），仔猪出生后吮食初乳，获得母源抗体产生被动免疫，从而抵抗大肠杆菌在肠道定居增殖，有效中和肠毒素，获得保护力。二、产品特点1、具有良好的免疫原性。针对致泻因子耐热肠毒素（ST）、不耐热肠毒素（LT）和主要黏附因子K88，采用基因工程技术构建的GE-3菌株，可以有效表达K88ac-ST1-LTB融合蛋白，并辅以氢氧化铝胶佐剂，在保留了K88ac和LTB良好免疫原性基础上，赋予了ST1免疫原性。2、构建菌株优良稳定。通过对菌株的安全性、有效性、菌种限定代次及保存条件、疫苗保存条件及保存期等试验，证实了该菌株是一株良好的疫苗候选株。3、该疫苗生产工艺科学、质量稳定。通过对菌株发酵培养的培养基、诱导剂及其诱导条件、通气量及菌液灭活等进行了筛选和优化，确定了工业化生产工艺，并通过安全性、效力检验等试验，批次间稳定。4、本疫苗安全性可靠、无毒副作用。采用实验动物模型接种，田间与区域本动物接种等试验进行安全性评价，表明本疫苗无肠毒素活性、无致病性，妊娠母猪临床母猪全部存活，均无流产、死胎和胎儿畸形等现象，分娩正常，所产仔猪生长发育良好。5、免疫效果确实。经仔猪免疫保护试验证实，灭活疫苗免疫初产怀孕母猪两次，新生仔猪吮食一天初乳后，用大肠杆菌强毒C83902（K88ac+、ST+和LT+）株攻击新生仔猪，均获得了较好的免疫保护：保护率为90~97.4%，比未免疫组高16.17%，平均日增重提高40g。三、安全试验、效力试验及推广应用效果情况1、安全试验（1）倍量接种安全试验于不同猪场随机选取妊娠母猪200头，于临产前15～20天，颈部肌肉注射本疫苗，每头10mL，分两侧注射。所有免疫接种的妊娠母猪均无任何不良反应，也无流产、死胎和胎儿畸形等现象，妊娠母猪分娩正常，所产仔猪生长发育良好。（2）田间扩大安全试验采用5个批次疫苗，试验母猪分别于产前30~35日和15~20日各颈部肌肉注射疫苗5mL，观察至分娩。约35日观察期内，试验母猪的临床表现正常，没有出现精神沉郁、厌食或注射局部变化，体温正常。5批疫苗使用的总体情况显示，疫苗免疫母猪所产仔猪健康，疫苗的使用对免疫猪的产仔率没有影响。5批疫苗共免疫母猪1299头，共产仔13627头，疫苗免疫母猪平均产仔10.5头左右；对照组共设置母猪126头，共产仔1249头，对照母猪平均产仔9.9头左右。2、效力试验（1）免疫攻毒表1新生仔猪吮食初乳4h后攻毒保护率对比妊娠母猪每头免疫剂量第一次免疫时间第二次免疫时间仔猪出生后吮食初乳4h后攻毒保护率2.5mL产前30～35产前15～20d83.9%（47/56）5.0mL95.8%（46/48）表2不同哺乳时间仔猪攻毒保护率对比（2）田间免疫效果试验疫苗批号吃乳时间（日）组别攻毒数量（头）存活数量（头）保护率/存活率（%）2009021试验组201785对照组10007试验组201995对照组1011014试验组201995对照组1022028试验组2020100对照组10220在辽宁瑞嘉原种猪场进行的田间试验结果：试验组（免疫K88ac-ST1-LTB三价灭活疫苗）比对对照组（未免疫）保护率高38.22%，仔猪成活率高16.17%，平均日增重高0.08Kg。表现出了明显的优势。（3）区域免疫效果试验于辽宁、河北、山东、黑龙江、吉林等地猪场随机选取妊娠母猪650头，于产前30～35d和15～20d，经颈部肌肉注射各免疫1次，每头5mL。免疫母猪共产仔猪7156头，发生新生仔猪大肠杆菌性腹泻126头，发病率为1.76%，死亡21头，死亡率为0.29%，对照组发病率为40.29%(139/345)、死亡率为20.58%(71/345)，两组的发病率和死亡率均呈极显著差异(P0.01)3、推广应用情况依据农业部批准《中华人民共和国农业部兽用生物制品临床试验批件，201002号》，于2010年02～11月在辽宁省黑山县、辽阳市、海城市、建平县、营口市5个猪场进行了区域性临床试验，试验情况如下。（1）5个猪场的试验仔猪与对照仔猪的发病数据显示，试验组共产仔猪13627头，发生黄白痢腹泻试验仔猪的数量为667头，试验仔猪发生黄白痢腹泻的数量占试验组仔猪总数量的4.89%（667/13627）；对照组共产仔猪1249头，对照仔猪发生黄白痢腹泻的数量为127头，发生黄白痢腹泻对照仔猪的数量占对照组仔猪总数的10.17%（127/1249），试验仔猪的发病率较对照仔猪的发病率低了5.28个百分点。（2）5个猪场对发生黄白痢腹泻的仔猪进行投药治疗后，试验组667头仔猪发生黄白痢腹泻死亡86头，占发生黄白痢仔猪数量的12.89%（86/667）；对照组仔猪127头发生黄白痢腹泻死亡23头，占发生黄白痢仔猪数量的18.11%（23/127）。试验组仔猪黄白痢的发生率降低的同时，伴随着抗生素的治疗后，试验仔猪较对照仔猪的黄白痢死亡率低了5.22个百分点。（3）5个试验猪场的母猪全部分娩正常，新生仔猪全部健活。5个试验猪场新生试验仔猪13627头，其中包括各种死因在内共死亡919头，试验组仔猪断奶存活12708头，断奶存活率为93.26%（12708/13627），5个对照猪场新生对照仔猪1249头，其中包括各种死因在内共死亡99头，对照仔猪断奶存活1150头，断奶存活率为92.07%（1150/1249）。断奶后仔猪存活率较对照仔猪的存活率高出1.19个百分点。四、效益分析产仔数/胎发病率（%）发病数治疗费用/头治疗费用病死率（%）病死数仔猪成本病死损失合计减少损失对照1010.171.026.006.1018.110.1823042.3648.4631.03免疫104.890.496.002.9312.890.0623014.5017.43说明：根据临床试验数据统计分析，假设一头母猪按单胎产仔10头，仔猪成本230元/头，跟胎免疫后新生大肠杆菌性腹泻发病率由10.17%降到4.89%，药物治疗后大肠杆菌腹泻病死率由18.11%降到12.89%，治疗费用节省支出3.17元，治疗后因病致死减少0.12头，降低损失27.86元。按现市场成本计算，每头母猪免疫疫苗后间接产生经济效益累计31.03元。五、疫苗使用说明1、主要成分与物理性状含灭活的基因工程菌株GE-3，灭活前至少1010CFU/ml。静置后，上层为淡黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。2、作用与用途用于预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻。3、用法与用量未经本疫苗免疫过的妊娠母猪分别于产前30～35日和15～20日各肌肉注射1次，每头5ml。以后产前15~20日免疫1次，每头5ml。