仙女虾遗传多样性的分子检测体系建立

本科毕业论文题目仙女虾遗传多样性的分子检测体系建立系（院）生物与食品工程系年级2012级专业生物科学（农业生物技术）班级（1）班学号060912110学生姓名秦涛指导教师韩晓磊职称实验师论文提交日期2016年5月20日常熟理工学院毕业论文I仙女虾遗传多样性的分子检测体系建立摘要仙女虾学名“枝额虫(Branchinella)”，是属于“钗额虫科(Thamnocephalidae)”的一种水生动物，其生命周期较短。该属物种在地球上生存已经超过两亿年，与恐龙同时代，以休眠卵渡过干旱时期，现存的该属物种起源较早，对研究生物进化有重要科学意义。本研究通过设计正交实验，分别从TagDNA聚合酶、引物和Mg2+共3种PCR原料因素的3个水平，筛选并确立了仙女虾ISSR-PCR反应最佳体系，然后通过温度变化梯度进行PCR，确定了适合的退火温度。根据所建立的ISSR-PCR反应体系，对仙女虾样本进行检验，结果显示，成功获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带。为后续该属种进一步的科研探究提供了重要的依据。关键词：仙女虾ISSR正交试验分子检测EstablishmentofmoleculardetectionsystemforgeneticdiversityofBranchinellathailandensisAbstractFairyshrimpscientificnamebranchamountofinsect(branchinellathailandensis),belongstothehairpinforeheadworm,aspeciesofaquaticanimals,itslifecycleisshorter.Thisspecieshasbeenlivingontheearthformorethantwohundredmillionyears,andtheageofthedinosaurs,inordertosurvivethedroughtofdormanteggs,theexistingspeciesoftheoriginoftheearlier,thestudyofbiologicalevolutionhasimportantscientificsignificance.Thisstudythroughtheorthogonaldesignexperiments,respectivelyTagDNApolymerase,primersandMg2+fromatotalofthreekindsofPCRinrawfactors3levels,screeningandestablishedthefairy常熟理工学院毕业论文IIshrimpISSRPCRoptimalreactionsystem,andthroughthechangeofthetemperaturegradientbyPCRtodeterminethesuitableannealingtemperature.AccordingtotheestablishedISSR-PCRreactionsystem,thefairyshrimpsamplesweretested,andtheresultsshowedthattheDNAbandswithclear,goodrepeatabilityandhighpolymorphismwereobtainedsuccessfully.Itprovidesanimportantbasisforthefurtherresearchofthisspecies.Keywords:fairyshrimp;ISSR;orthogonaltest;moleculardetection常熟理工学院毕业论文III目录1引言…………………………………………………………………………………11.1仙女虾生物学简介…………………………………………………………11.2ISSR分子标记技术……………………………………………………………21.3国内外仙女虾的研究进展……………………………………………………22.材料和方法………………………………………………………………………32.1材料来源………………………………………………………………………32.2实验试剂………………………………………………………………………32.3实验器材………………………………………………………………………42.4实验方法………………………………………………………………………42.4.1基因组DNA的提取（SDS法裂解）…………………………………42.4.2DNA电泳检测……………………………………………………………42.4.3引物初筛…………………………………………………………………52.4.4PCR反应体系的优化……………………………………………………52.4.5退火温度确定……………………………………………………………52.4.6ISSR-PCR反应…………………………………………………………52.4.7PCR产物检测……………………………………………………………52.4.8数据分析…………………………………………………………………63.结果………………………………………………………………………………63.1仙女虾DNA的提取结果……………………………………………………63.2引物筛选和正交试验结果……………………………………………………7常熟理工学院毕业论文IV3.3退火温度梯度PCR结果……………………………………………………83.4ISSR-PCR反应结果…………………………………………………………104.讨论………………………………………………………………………………104.1采用正交法优化ISSR-PCR体系……………………………………………105.小结………………………………………………………………………………126.展望………………………………………………………………………………12参考文献…………………………………………………………………………13致谢…………………………………………………………………………………14常熟理工学院毕业论文11引言1.1仙女虾生物学简介仙女虾是一种水生生物,因为其外形像虾,游动时却与虾相反,肚子向上,在水中飘逸生动,就像是仙女一般,所以有了这个名字。在生物学上,这种动物属于节肢动物门,腮足纲,无甲目。本次实验所使用的品种为红尾仙女虾,属于钗额虫科,枝额虫属。这种生物经常能在农村的水田，沟渠等地方见到，但因为生命周期短，所以发现的较少，只有印度和泰国有过相关的文献记录。红尾仙女虾的双眼为黑色,身体为半透明浅黄色,会因为所食用的藻类而呈绿色,尾部是红色分叉像剪刀一样,腹部是它的对足,多而密，成体大约有2-2.5cm,寿命为2~3个月。仙女虾在全球分布广泛,由于品种繁多，不仅是外形,连生活习性也都各不相同。卵非常小，约几十个加起来才有一粒小米的大小,新鲜的卵为黄色,随着时间的增加会逐渐变为棕色。卵外壳的保护能力非常强,不管是干旱，还是高温，冻害都有很强的抵抗能力，而且生命力特别顽强，在干枯的水塘许多年后，只要有合适的环境，依然能够孵化。仙女虾的生命周期通常都很短，根据品种不同，在1-4个月不等。不稳定的生活环境使得仙女虾能够在很短的时间内快速成长,并且快速地繁育后代。刚刚孵化出来的幼苗肉眼几乎不可见，需要在黑色的背景下，利用光源才可勉强观察，可以看到幼虫利用尾部以弹跃的方式来游动;一天过后就能长到大约1mm左右,此时已经较为方便地观测了，会看见长成的复眼和新的两条游泳肢;随后两天会继续生长,游泳肢增加一对并长到和原先的一样长，然后会逐步改变成仰泳的游动方式;期间继续快速生长，直至两周左右生长发育变缓，达到性成熟，然后会多次产卵，直至死亡。常熟理工学院毕业论文21.2ISSR分子标记技术ISSR(intersimplesequencerepeat)标记是一种在简单重复序YU(SSR)基础上发展起来的新型的分子标记，由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等(1994)提出。这是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在的SSR特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设定引物，无需预先克隆和测序。用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16-18个碱基序列，由1-4个组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中的SSR的5’和3’末端结合，通过PCR反应扩增SSR之间的DNA片段。在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增。SSR在真核生物中的分布是非常普通的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的ISSR-PCR可以检测基因组许多位点的差异。与SSR-PCR相比，用于ISSR-PCR的引物不需要预先的DNA测序，也正因为如此，有些ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域而无扩增产物，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性和多态性。现己广泛应用于药用植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等方面的研究。ISSR标记技术试验操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤；重复序列和锚定碱基的选择是随机的，无需知道任何靶标序列的SSR背景信息，从而降低了技术难度和实验成本；无需活材料，无组织器官特异性，能实现全基因组无编码取样：采用了较长的引物(17。24bp)，退火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，增强了实验可重复性。ISSR标记的缺点就是，在PCR扩增时需要一定时间摸索最适反应条件；呈显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。1.3国内外仙女虾的研究进展仙女虾的品种繁多，截止到目前发现并已有记录在册的就有300多种，因海洋环境较陆地而言更加稳定，所以大多数都是生活在海水中的品种。对于仙女虾的开发利用较为成熟的海水卤虫（一般叫做“海水丰年虾”），主要用于水产养殖上，作为活体饵料投食虾蟹鱼等幼体；美国，台湾等地也有把其以水生宠物的形式向消费者出售；中国沿海等地甚至已经把它搬上餐桌，作为特色菜品。我国的淡水养殖产业发展迅速，但是对于淡水仙女虾的这一系列品种研究和开发却很少涉猎，而且国内外也鲜有相关的文献记载，更不用说生产和养殖了。所以，对于仙女虾的人工养殖和繁育以及产业化开发具有非常广阔的发展前景，不但可以作为常熟理工学院毕业论文3新品种开拓淡水观赏水族的市场，而且可以作为活体生物饵料和商品化虾片解决体量巨大的淡水水产育苗产业的问题。本次研究对象是红尾仙女虾(Branchinellathailandensis)，钗额虫科枝额虫属，是一种淡水仙女虾，其生命周期短且季节性较强的特点，使得地球上发现的活体不多，仅在印度和泰国有少量该物种的文献记载。近年来，仙女虾在我国也有较高的曝光率，从2008年起先后在云南、河南、新疆、河北、和江苏有过该物种的报道。2材料和方法2.1材料来源用于本实验的红尾仙女虾样本由江苏农牧科技职业学院提供虾卵，自行孵化并饲养至成体，原产地为泰国。2.2实验试剂表1主要药品名称及厂家Tab1.NamesandmanufacturersoftheMajorreagent名称厂家无水乙醇（分析纯AR）上海试一化学试剂有限公司异戊醇（分析纯AR）中国医药（集团）上海化学试剂公司NaCl（分析纯AR）淮安化工厂乙酸中国上海试剂一厂EDTA（乙二胺四乙酸二钠）中国医药（集团）上海化学试剂公司盐酸（分析纯AR）宜兴市腾兴化工有限公司饱和酚（分析纯AR）AuyooBiotechnology.luc续表1琼脂糖上海宝生物工程（大连）有限公司TaqDNA聚合酶上海宝生物工程（大连）有