代谢物的结构测定.

代谢物的分离和结构测定体内药分第五专题代谢物的分离和结构测定药物代谢（drugmetabolites）=生物转化（biotransformation）任何药物在体内都有其发挥疗效的时效期，因为大部分药物在体内都会被代谢而失去活性，代谢可以使脂溶性药物转变为水溶性化合物，从而加速药物从体内的排泄。代谢物的分离和结构测定药物代谢研究在新药研发中的作用：代谢研究与创新药物的开发和筛选药物代谢与药物的毒性评价药物代谢研究与代谢相互作用代谢物的分离和结构测定体内代谢的一般规律制备代谢物的生物转化方法代谢物的识别与结构鉴定主要内容：代谢物的分离和结构测定肝脏代谢肝外药物代谢药物代谢酶的调节影响药物代谢的因素代谢的一般规律：代谢物的分离和结构测定药物的消除排泄原型排泄代谢代谢物有的体内几乎检测不到，首过+体内代谢有的能检测到少许代谢的一般规律：一相代谢（phaseⅠ）或生物转化，它是指在药物的分子上引入新的基团或除去原有的小基团的官能团反应；生成可与二相反应的官能团：-OH,-COOH,-NH2,-SH等二相代谢（phaseⅡ）或称结合反应，在这相反应中，一些内源性小分子和药物或一相代谢产物结合，生成的结合物极性增加，脂溶性降低，加速药物从体内的排泄。药物的代谢一般分为两相：代谢的一般规律：Ⅱ相代谢反应主要为结合反应，Ⅱ相代谢物是药物排出体内的主要形式。CH3CH3OCH2CHNHCH2CH2CH3OOCH3CH3CH3CH3OCH2CHNHCH2CH2OHCH3OOHCH3PhaseⅠ非洛普代谢物M2CH3CH3OCH2CHNHCH2CH2OSOHOOCH3OOHCH3代谢物M3PhaseⅡ极性变大过程Ⅰ相代谢Ⅰ相反应是药物在体内代谢转化的关键性步骤，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，它可以影响到药物的许多重要的药动学特性，如药物的半衰期、清除率和生物利用度等。Ⅰ相代谢肝脏代谢微粒体酶系主要存在于肝细胞或其他（如小肠黏膜、肾、肾上腺皮质细胞等）的内质网的亲脂膜上。其中最重要的一族存在于肝脏中的氧化酶被称为肝微粒体混合功能氧化酶系统或称单加氧酶。按细胞分布划分：微粒体药物代谢酶系肝脏代谢非微粒体酶在肝内和血浆、胎盘、肾、肠黏膜及其他组织中均有存在，在体内除与葡萄糖醛酸结合外的其他缩合，以及某些氧化、还原及水解(除酰胺键外)反应均为该酶系所催化。通常凡是结构类似于体内正常物质、脂溶性较小、水溶性较大的药物都由这组酶系代谢。1）细胞浆可溶部分的酶系。2）线粒体中的酶系3）血浆中酶系。非微粒体酶系肝脏代谢肝微粒体酶系（氧化、结合）肝外微粒体酶系（氧化、结合）肝非微粒体酶系（葡萄糖醛酸化、乙酰化、硫酸化、乙醛脱氢酶、水解反应）肝脏代谢肝脏是药物的主要代谢部位，代谢也可发生在血浆，胃肠道，肾脏，肺等组织细胞中。药物代谢反应是酶催化反应。代谢酶位于微粒体，内质网，胞液，溶酶体或核膜和胞浆膜中。肝脏是动物体内含代谢酶最丰富的部位。肝脏代谢肝细胞的组成示意图代谢酶主要存在于肝微粒体中，其次是溶酶体及线粒体中Ⅰ相代谢一相代谢主要包括的反应类型有氧化，还原和水解。氧化反应C-,N-,O-脱烃化N-,C-,S-氧化羟化反应去氨基化反应去硫化反应去卤素反应醇的氧化醛的氧化还原反应硝基还原偶氮还原醛的还原水解反应酯类的水解酰胺类的水解按常见催化反应类型划分，Ⅰ相代谢氧化反应O-氧化反应脱甲基反应羟化反应脱氨基反应P450依赖的混合功能氧化酶系P450依赖的混合功能氧化酶系(MFO)酶的分类酶的结构酶催化的代谢反应P450依赖的混合功能氧化酶系CYP后面跟一个数字，表示一个家族，然后是一个字母表示亚族的字母，最后的数字表示基因。酶的分类：ＦＤＡGuidance：新药报批时要求Ｐ４５０酶实验P450依赖的混合功能氧化酶系P450依赖的混合功能氧化酶系1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性不强.3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性.P450酶的生物学特性P450依赖的混合功能氧化酶系1.CYP450酶的aa一级序列变化多端，但是它们的空间折叠结构在进化过程中始终保持不变，都包含特定的功能域。2.所有CYP450酶中都具有血红蛋白结合位点。3.CYP450酶是血红素-硫醇盐蛋白，最保守的区域与酶的催化功能，和与血红蛋白结合有关。这个区域位于蛋白质的核心.4.超变区通常是aa的膜定位序列或底物识别位点，它的有效的变化可以适应催化反应的进行。5.在所有情况下，底物结构与CYP450核心对形成氢键连接非常重要。酶的结构CYP450假定的功能域P450依赖的混合功能氧化酶系NH2==COOH膜定位片段细胞色素b5结合位点与磷酸化位点底物识别位点氧结合位点NADPH-CYP450还原酶结合位点高度保守的区域超变区与酶的催化功能对应于外界的反应通式：1.RH代表可氧化的药物底物，ROH代表羟化代谢物。2.CYP450是一种耦合脂质盐。耦合状态下，CYP450发挥水解酶的功能；去耦合状态下CYP450发挥高能氧化作用。药物如果在微粒体脂质体的作用下改变了CYP450的耦合-去耦合平衡，就会改变自身的代谢途径和代谢产物P450依赖的混合功能氧化酶系NADPH+H++O2+RHNADP++H2O+ROHCYP450酶催化的氧化反应P450依赖的混合功能氧化酶系DRUGO2NADPHH+微粒体DRUG+ONADP+H2OP450依赖的混合功能氧化酶系（二）CYP450催化循环的作用机制药物在微粒体中氧化的示意图COhuCYP-Fe+2DrugCOO2e-e-2H+H2ODrugCYPR-AseNADPHNADP+OHDrugCYPFe+3PCDrugCYPFe+2DrugCYPFe+2DrugO2CYPFe+3OHDrugP450依赖的混合功能氧化酶系1.羟化反应ClNNH3CNFClNNHOH2CNF咪达唑仑CYP3A4还有如保泰松、卡马西平、布诺芬等药物，羟化位置为苯环的对位上。一般选择在较活泼的位置上。M.F.O.系统催化的氧化反应P450依赖的混合功能氧化酶系2.环氧化反应OHNOHOHNO非那西丁扑热息痛CYP1A23.脱烷基反应N-,S-P450依赖的混合功能氧化酶系4.氧化脱氨基反应5.脱卤素反应BrCHClF3CH2COHCF3F3CCOOH图9：氟烷的氧化脱卤素P450依赖的混合功能氧化酶系6.N-氧化反应7.S-氧化反应丙咪嗪的N-氧化代谢反应SN(CH2)3N(CH3)2ClSN(CH2)3N(CH3)2ClO氯丙嗪CYP3A4P450依赖的混合功能氧化酶系M.F.O.系统催化的还原反应1.偶氮和硝基化合物的还原反应由细胞色素P450催化（或被NADPH-细胞色素C还原酶催化），偶氮化合物的还原反应导致了磺胺类的发现。硝基化合物的还原反应在发生时是分部进行的。-NO2NO2NONHOHNH2e-+2H+2e-+2H+H2O+2H+2e-P450依赖的混合功能氧化酶系NNOH2NRNNHOHH2NR氧二氮杂茂2.还原化合物能还原成母体有机物。一些氮杂环化合物通过还原会开环，产生不稳定的产物，再进一步重排或水解，产生终产物。非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应人体内许多与混合功能氧化酶系无关的酶也能氧化药物，这些酶有醇脱氢酶、醛脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、胺氧化酶、芳香化酶和烷基肼氧化酶等，它们主要参与内源性物质的代谢。非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应1.其他氧化酶2.酯酶（参与酯类、酰胺类、肼类和氨基甲酸盐类的水解）3.过氧化物水解酶醇脱氢酶催化醛氧化的酶微粒体黄素单氧化酶系（唯一哺乳动物中的黄素蛋白羟化酶）前列腺素合成酶芳氧化酶烷基肼氧化酶髓过氧化物酶非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应1.醇脱氢反应2.醛的氧化反应CH3CH2OHH3CCOHNAD+NADH+H+图11：乙醇被醇脱氢酶氧化H3CCHOCH3COOHOH2NAD+NADH+H+图12：乙醛的氧化非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应3.黄嘌呤氧化反应NNNNHH3COOCH3NNNNHH3COOCH3HO图13：茶碱的氧化非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应NCH2CH2NH2HOHOMAONCH2CHOHOHNCH2COOHHOH醛脱氢酶5-羟色胺5-羟吲哚乙醛5-羟吲哚乙酸图14：5-羟色胺的氧化反应4.胺氧化反应单胺氧化酶非微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应5.芳香化反应COSCoAO2OH2FADFADH2COSCoA图15：环己酸CoA的芳香化反应还原反应2.还原反应还原反应主要针对药物结构中的羰基、羟基、硝基和偶氮基等功能基团进行反应。通常脂肪族硝基化合物不能被还原，只能脱硝基生成亚硝酸类。还原反应硝基还原反应羟基还原反应羰基还原反应水解反应3.水解反应一相反应的另一种代谢方式是酯类、酰氨类、肼类和氨基甲酸盐类的水解。它们在正常条件下不水解，缓冲液中也能保持一定的稳定性，只在特点的酶作用下水解。水解反应1）酰胺水解反应OC2H5NHCOCH3NH2OC2H5CH3COOH+非那西丁水解为对乙氧基苯胺血浆酯酶肝酰胺酶水解反应酯类水解反应酯类水解反应2）酯的水解水解反应3）肼类和氨基甲酸类的水解NCONHNH2NCOOHNH2NH2H2O+图19：异烟肼的水解与药物代谢酶相关的内源性物质代谢1.药物代谢酶具有催化多种不同反应的功能，除了对药物进行生物转化以外，大多数药物代谢酶也参与内源性物质的代谢。类固醇甾体生物合成及代谢在很大程度上依赖于混合功能氧化酶系。2.尤其注意的是，混合功能氧化酶的活性是由外源化合物刺激的频率和强度决定的，这在一定程度上会影响内源性物质的代谢转化率。因此,化学药物的代谢会引起混合功能氧化酶系统的改变，从而引发高血脂和心血管等疾病。与药物代谢酶相关的内源性物质代谢Ⅱ相代谢第二步称为Ⅱ相代谢反应，药物在这一相反应中与一些内源性的物质（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。通常认为一相反应使药物产生或去掉一个基团，从而使二相反应得以发生，因此，二相反应应该是真正的解毒途径。有许多药物可同时发生一相和二相代谢，而不同代谢途径的反应可能会竞争同一底物。另外，也有些药物会经过代谢而被激活。Ⅱ相代谢Ⅱ相代谢结合类型酶功能基团葡萄糖醛酸结合UDP-葡萄糖醛酸转移酶-OH,-COOH,-NH2,-SH硫酸化反应磺基转移酶-NH2,-SO2NH2,-OH甲基化反应甲基转移酶-OH,-NH2乙酰化反应乙酰基转移酶-NH2,-SO2NH2,-OH,-COOH氨基酸结合反应-COOH谷胱甘肽结合反应谷胱甘肽-S-转移酶环氧化物，有机卤化物脂肪酸结合反应-OH缩合反应各种功能基团外源性解毒途径内源性解毒途径Ⅱ相代谢参与这类反应的酶被称为尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UTGs）药物的二相反应及酶系（一）葡萄糖醛酸结合反应（一）葡萄糖醛酸结合反应1.发生部位：ROH，Ar–OH，RNH2，RNR’R’’,R–CO–NH2，RSH2.结果：1）极性增大2）areionizedatphysiologicpH(pKa4)3）分子量增加176进一步确证：对代谢物进行处理，使其水解。可判断结合类型（一）葡萄糖醛酸结合反应具有-OH基团的化合物是最常见的葡萄糖醛酸结合反应的底物，醇、酚、羧酸都可以生成O-葡萄糖醛酸苷，值得注意的是，反应前的α-葡萄糖醛酸在结合反应会后变成β-葡萄糖醛酸苷。醚式葡萄糖醛酸苷(稳定)酰基葡萄糖醛酸苷（不稳定）1.O-葡萄糖醛酸苷O-葡萄糖醛酸苷由胆汁排泄释如肠道后，又可由α-葡萄糖醛酸苷酶催化分解成母体化合物，后者可能会被重新吸收，形成“肝肠循环”。（一）葡萄糖醛酸结合反应1.酚类2.醇类（一）葡萄糖醛酸结合反应3.羧酸类（一）葡萄糖醛酸结合反应芳伯胺、酰胺、叔胺、磺胺等药物生成N-葡萄糖醛酸苷。根据所产生的葡萄糖醛酸结合物的化学结构，N-葡萄糖醛酸结合物的底物可分为形成非季氮化合