仪器分析讲稿(第3章液相)

InstrumentalAnalytical仪器分析高效液相色谱分析HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC第3章内容提要1高效液相色谱法的特点2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理4液相色谱法的固定相5液相色谱法流动相6高效液相色谱仪7高效液相色谱分离类型的选择8高效液相色谱法应用实例9液相制备色谱10毛细管电泳§3.1高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。高效液相色谱是20世纪70年代迅速发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱+气相色谱理论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器）。二、特点1.高压:可达150~350×105Pa2.高速:例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时.3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米）4.高灵敏度：紫外检测器10-9g；荧光检测器10-11g三、应用范围气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70-80%。。因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。•从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，即可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素与GC比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；主要区别：流动相不同.液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：一、柱内展宽1.涡流扩散项：He=2λdpλ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，λ变得很小，所以He值比较小。2.纵向扩散项65/-1：Hd=CdDm/u；当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数Dm比在气体中小4-5个数量级，在LC中可忽略,GC中重要。3、传质阻力项组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。（1）固定相传质阻力项（主要发生在液－液分配色谱中）当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。扩散系数。试样分子在固定液内的固定液的液膜厚度。。容量因子）有关的系数是与式中sfssfssdkDdCHD(C)33(2•采取措施：•1）液-液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。•2）采用扩散系数大的液相固定相。•3）减小流动相的流速，改善传质。（2）流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)i.流动的流动相中的传质阻力项Hm当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动速度不一样从而引起峰形变宽。.D(C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。容量因子）函数。是与式中udkuDdCHmmmmpmmii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。.D,C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。分数及容量因子有关。相所占据部分的它与颗粒微孔中被流动是一常数式中uduDdCHmmsmmpmssm由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+Cu由于B/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：H=A+Cu)63()(2:222uDdCDdCDdCudCdHsfsmpmsmpmmdp板高度的总变化色谱峰扩展所引起的塔1.提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度。（选粒径小的、分布均匀的薄壳型担体dp≤10μm,5μm目前应用最广泛，提高装柱技术，湿法匀浆法装柱）2.选粘度小、低流速的流动相（甲醇，约1ml/min）3.适当提高柱温以降低流动相粘度。4、采用最佳流速。5、减小柱外展宽。其中，减小粒度是提高柱效能的最有效的方法。液相色谱法中提高柱效的方法HPLC与GC的H-u曲线见图3-1：（1）两者曲线形状相似，都有一个H最小值；（2）HPLC的H最小值比GC的最小值小一个数量级以上，柱效更高；（3）HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一个数量级以上。二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽：主要由进样所引起；•进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。•由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。•解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心1~2mm处。b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.•解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.InstrumentalAnalytical仪器分析•液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些?与气相色谱相比较,有哪些主要不同之处?解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。•1、在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（）。•A减小填料粒度B适当升高柱温C降低流动相的流速D增大流动相的流速•2、高效液相色谱中，可以忽略不计的影响色谱峰扩展的因素是（）。•A涡流扩散项B纵向扩散项C传质阻力项D柱外展宽•3、在液相色谱中，纵向扩散项Hd＝B/u较小，通常可以忽略不计。（）•4、要提高液相色谱分离的效率，必须提高柱内填料填装的均匀性和________以加快传质速率，其中_________是提高柱效的最有效途径。练习§3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱1.特点：a.流动相和固定相都是液体b.两相应互不相溶，有明显的分界面2.分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。•分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.3.解决固定液流失问题方法：1）一般为了避免固定液的流失，对于亲水性的固定液常采用疏水性的流动相，而疏水性的固定相则采用亲水性的流动相，从而使固定液不至于由于溶解于流动相而带走流失，即所谓的正反色谱法。•问题：何谓正相色谱及反相色谱？在应用上有什么特点？答：在色谱法中，流动相的极性小于固定液的极性，称为正相色谱；在色谱法中，流动相的极性大于固定液的极性，称为反相色谱。在应用上，正相色谱主要用于分离极性物质；反相色谱主要用于分离弱极性或非极性物质。2）在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液也会不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果。为了更好地解决固定相从载体上流失的问题，采用化学键合固定相。•问题：何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？•答：利用化学反应将固定液的有机官能团共价键合在载体表面的流离羟基上形成的固定相称为化学键合固定相。•优点：固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失，增加了色谱柱的稳定性及寿命；可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，可应用与多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。•目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支，液-液分配色谱极少采用。化学键合固定相•根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（≡Si-O-C)；硅氧硅碳键型（≡Si-O-Si-C);硅碳键型（≡Si-C)；硅氮键型（≡Si-N)。•硅烷化反应：二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）1.特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。（溶质分子X与溶剂分子S对吸附剂表面竞争吸附）3.结论69/-5：如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应减小。显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大.4.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象.三、离子对色谱法1.特点：对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便.2.分离机制（P71）：将一种或多种与溶质电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为，采用液-液分配原理进行分离。3.分离过程：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间进行分配.X+水相(被测离子)+Y－水相(对离子)↔X+Y－有机相（疏水）4.分类•正相离子对色谱法：极性固定相-非极性流动相。•反相离子对色谱法：非极性的疏水固定相，含有对离子Y－的甲醇－水（或乙腈－水）溶液作为极性流动相.试样离子X＋进入柱内以后，与对离子Y－生成疏水性离子对X＋Y－，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。5.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样.另外，还可借助离子对的生成给试样引入此外吸收或发荧光的基团，以提高检测灵敏度。四.离子交换色谱法1.分离机制70/2；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。2.适用范围70/3；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法进行分离。离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆交换反应：)83(()73(N3NM443树脂）＋（树脂）＋阴离子交换：树脂）＋（树脂）＋（阳离子交换：＋＋NRXClNRClXSOMaSOa3.结论：亲合力高的，在柱中保留值就愈大，分配系数也愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。4.应用：a.分离离子或可离解成离子的化合物。b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.五、离子色谱法这是20世纪70年代中期发展起来的一项新的液相色谱法，很快发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法。1.固定相:离子交换树脂流动相:电解质溶液检测器:电导检测器主配件：抑制柱（抑制流动相中强电解质背景离子的干扰）2.流程图：fig3-2例：•阴离子交换柱（分离柱）：R—OH－＋+Na+Br-(待测