光动力疗法对白念珠菌细胞壁蛋白基因表达的影响

光动力疗法对白念珠菌细胞壁蛋白基因表达的影响研究项目情况名称：光动力疗法对白念珠菌细胞壁蛋白基因表达的影响类别：自由申请项目研究类型：应用基础研究申请金额：6万元研究期限：2011年10月-2013年10月申请者及项目组情况申请人：杨阳博士副主任医师项目组人员统计总人数高级中级初级在读硕士生72131参加单位：1一、研究内容和意义（摘要）白念珠菌粘附于阴道上皮细胞引起炎症刺激以及阴道上皮局部免疫防御机制低下是复发性阴道念珠菌病（RVVC）发病的两大原因，白念珠菌常以生物膜的形式存在，在生物膜微环境内，白念珠菌能有效地抵御机体免疫力和抗真菌药物，诱导抗真菌药物耐药性的增加，从而导致临床白念珠菌药物治疗效果不理想；而细胞壁蛋白基因HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和细胞粘附过程起重要作用；光动力疗法对微生物有抑制作用，但具体作用机制仍未明确；本课题通过构建白念珠菌生物膜模型，分析光动力疗法作用前后白念珠菌的细胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表达变化，白念珠菌生物膜生长动力活性的变化，探讨光动力疗法对防治复发性阴道念珠菌病的作用机制。二、立论依据VVC最常见的真菌感染性疾病，主要由白念珠菌引起，它是生育期妇女最常见的外阴阴道炎症。RVVC病因较为复杂，治疗有一定的难度，从而对妇女的身心健康造成很大影响。白念珠菌常以生物膜(biofilm)的形式存在。在生物膜这样一个微环境内，白念珠菌能有效地抵御机体免疫力和抗真菌药物，诱导抗真菌药物耐药性的增加，从而导致临床治疗困难。因此关于白念珠菌生物膜的有效治疗方案的研究刻不容缓。1、白念珠菌生物膜是诱导抗真菌药物耐药的生物基础生物膜是一种独特而复杂、相互依存的与表面有关的微生物群体。对各种抗真菌药物具有高度耐药性是白念珠菌生物膜与游离态白念珠菌最大的区别之一。白念珠菌生物膜对抗真菌药物耐药的机制尚未明了。生物膜相关微生物耐药机制包括:生物膜细胞低生长率;ECM生成后产生物理屏障,妨碍药物渗透入生物膜;生物膜耐药相关基因的表达。但它们在白念珠菌生物膜耐药中的作用仍不确定。2细胞壁蛋白HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和细胞粘附过程中起重要作用白念珠菌粘附于生物材料等固体表面形成生物被膜，这和游离培养截然不同，是细胞内启动了特殊的转录机制，引起复杂的生理变化。这期间经历了粘附和聚集、信号转导、细胞内基因的选择性表达等过程。其中粘附在整个过程中起着重要的作用。主要表现在细胞壁蛋白AlS3的缺失，会导致生物膜形成障碍，在导入能自主表达该基因的载体后，又能恢复形成生物被膜的能力。3光动力疗法应用于抗白念珠菌的前景光动力疗法：是结合光敏剂、光、氧三种无害物质造成局部光氧化损伤的治疗方法。光动力疗法广泛应用在肿瘤及皮肤疾病治疗领域目前光动力治疗微生物的研究仍处于初级阶段，部分体外实验中光动力疗法已被证实具有抗微生物的作用。例：巴西Betania等发现光动力疗法在特定条件下可以灭活体外培养的口腔上皮细胞生长和粘附的白念珠菌。光动力疗法应用受光敏剂选择、微生物光敏剂吸收率、光源选择、照射环境及时间等多因素影响，具体的治疗效果还需进一步研究。鉴于以上问题，进一步研究光动力疗法替代药物能否影响白念珠菌生物膜粘附、成熟、致病过程，对于进一步开展阴道念珠菌病的防治具有重要意义。既然白念珠菌生物膜的粘附、成熟以及作用局部阴道上皮炎症致病过程中扮演着重要的角色，而细胞壁蛋白HWPI和ALS3在白念珠菌生物膜形成和细胞粘附过程中起重要作用，光动力疗法是否能通过破坏念珠菌生物膜而达到的治疗阴道念珠菌病值得我们进一步深入探讨。因而，我们的研究假说是光动力疗法通过减低细胞壁蛋白HWPI和ALS3降低白念珠菌生物膜粘附性致抑制白念珠菌，从而发挥治疗阴道念珠菌病和防止复发的作用。4本项目的特色与创新之处。1、本研究针对阴道念珠菌病首次提出非药物治疗方案——光动力疗法，从白念珠菌生物膜致病过程入手，探讨光动力疗法对白念珠菌生物膜体外模型粘附性作用机制，为光动力疗法治疗阴道念珠菌病的理论研究找到新的切入点和开拓新的思路。2、本研究在国内首次通过检测光动力疗法中光敏剂对白色念珠菌生物膜的最低抑菌浓度，及光动力疗法处理前后白色念珠菌的细胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表达变化，从而分析和探索光动力疗法对白色念珠菌生物膜的抑制作用。3、本研究的开展为进一步拓展光动力疗法治疗范围奠定基础。三、研究方案1、研究目标：构建白念珠菌生物膜体外模型。通过检测光动力疗法中光敏剂白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度，及光动力疗法处理前后白念珠菌的细胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表达变化，从而分析和探索光动力疗法对白念珠菌生物膜的抑制作用。2、研究内容：１.成功构建白念珠菌标准株和临床分离株生物膜体外模型，并利用激光扫描共聚焦显微镜系统观察其三维结构。2.微量稀释法测定光动力疗法中光敏剂白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度。3.XTT法减低法分析光动力疗法治疗前后白念珠菌生物膜生长动力活性的变化。4.用定量RT-PCR方法，检测光动力疗法处理前后，白念珠菌的细胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表达变化。3、拟解决的关键问题1.白念珠菌生物膜体外模型的成功建立。2.设计合理的基因相关引物。3.建立稳定性好、重复性高的实验方法。4、采取的研究方法：（1）构建白念珠菌生物膜的体外模型。将白念珠菌菌悬液接种于96孔微量培养板中，使白念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面，形成白念珠菌生物膜结构。激光扫描共聚焦显微镜系统初步鉴定白念珠菌生物膜的形成。（2）测定光动力疗法中光敏剂白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度。采用微量稀释法将光敏剂100μl加到96孔板，再加入浓度为1×106cFu／mI白念珠菌悬浮液100μl，用光动力疗法处理后，以无菌生长的最小药物稀释度作物各菌株的最低抑菌浓度（MIC）。（3）分析光动力疗法治疗前后白念珠菌生物膜生长动力活性的变化。利用XTT减低法，把XTT-甲萘醌与光动力疗法处理前后的念珠菌生物膜共培养，用酶标仪检测波长490nm处，生物膜生长各时间段的吸光值，观察光动力疗法前后其生长动力曲线变化。结合上述方法的结果，分析和推测光动力疗法对白念珠菌及其生物膜的抑制作用。（4）检测光动力疗法处理前后，白念珠菌的细胞壁蛋白基因HWP1和ALS3表达变化。采用RT-PCR等分子生物学方法，从白念珠菌标准株和临床分离株的全基因组分别扩增出胞壁蛋白基因HWP1和ALS3，并测序鉴定正确。用紫外分光光度计测定光动力疗法处理前后，白念珠菌标准株和临床分离株中两种基因表达量的变化。用SPSS进行统计学分析。5、技术路线：构建白念珠菌生物膜的体外模型和光动力疗法实验：6、可行性分析1、本课题依托于广州医学院，广州医学院呼吸疾病实验室是广东地方高校中唯一一个国家重点实验室。经过长期的相关研究积累，相关条件具备，本课题组一直致力于白色念珠生物膜构建和光动力疗法对其抑制及其机制研究。目前已经成功构建了白念珠菌生物膜。2、申请者长期从事真菌的临床与实验研究，系统学习并掌握分子生物学相关技术，曾参与完成国家自然科学基金“新生隐球菌在吞噬细胞内寄生机制的研究”（编号：30370082）科研课题，具有扎实的科研基本功和创新精神。3、课题主要成员为广州医学院武警广东省总队医院青年科研骨干或硕士研究生，长期从事光动力疗法的相关研究，曾参与省、部级科研课题广东省科技厅资助项目（编号：2003C33907）广东省科技计划重大专项（编号：2006A20101006）和广东省科技计划重点项目（编号：2004B31201019）两项，并完成其中部分工作，撰写多篇论文。通过前期研究已熟练掌握白念珠菌生物膜模型等与本课题密切相关的关键技术，已掌握了一套完善的实时PCR研究实验操作规程。组成人员结构合理，分工明细，相互配合默契，有能力如期完成本申报项目的研究工作。7、年度研究计划及预期进展2011年10月—2012年6月：（1）分别构建白色念珠标准株和临床分离株菌生物膜的体外模型，用激光扫描共聚焦显微镜系统初步鉴定白念珠菌生物膜的形成。（2）测定光动力疗法中光敏剂白念珠菌生物膜的最低抑菌浓度。（3）测定光动力疗法治疗前后白念珠菌生物膜生长动力活性的变化。（4）描绘生长动力曲线。2012年7月—2013年10月：根据Genebank中白念珠菌胞壁蛋白基因HWP1和ALS3的保守序列设计引物。利用TRizol按照说明书提取总RNA，采用Real-timePCR方法扩增，并测序鉴定正确。用紫外分光光度计测定光动力疗法处理前后，白念珠菌标准株和临床分离株中两种基因表达量的变化。用SPSS进行统计学分析。资料的统计、分析、总结，论文的撰写。预期结果：通过上述研究，预计发表核心论文3-4篇，SCI文章1-2篇。四、研究条件与基础本课题组一直致力于白色念珠生物膜构建和光动力疗法对其抑制及其机制研究。自2008年始，在临床观察中，发现多例尖锐湿疣患者合并复发性阴道念珠菌病，用光动力疗法治疗后大大降低了复发性念珠菌病的复发。之后，开始关注和追踪国际有关光动力疗法抑制白念珠菌生物膜的进展，并收集相关临床病例。目前已经成功构建了白念珠菌生物膜，但光动力疗法抑制白念珠菌生物膜的作用机制还有待于进一步深入研究。申请人杨阳，男，1971年出生。广州医学院附属武警医院皮肤科主任，副主任医师，医学博士。现任武警部队皮肤性病学会副主任委员，广东省皮肤性病学会委员，广东省医师学会皮肤分会委员，广东省医学激光学会委员。2005年毕业于上海第二军医大学附属长征医院皮肤性病学专业，并获得博士学位。就读博士期间，杨阳曾参与国家自然科学基金“新生隐球菌在吞噬细胞内寄生机制的研究”（编号：30370082），并完成其中部分工作，撰写多篇论文。主要负责本项目的实验设计、组织实施、实验指导和统计等工作。申请人杨阳近期发表的论文:[1].杨阳,廖万清,郭秀军.新生隐球菌对鼠小胶质细胞细胞骨架蛋白质组的影响.临床皮肤科杂志.2007,36（4）：208-211.[2].杨阳,廖万清,徐红.无荚膜隐球菌CAP64对小胶质细胞凋亡的影响.解放军学杂志.2005,30（6）：486-487.项目组主要成员及发表文章：1、刘旖旎，女，1980年出生。2004年就读广州中医药大学第一附属医院皮肤性病专业，并获得硕士学位。现在是广州医学院附属武警医院皮肤科主治医生，现任广东省中西医结合学会医学美容专业委员会青年委员。主要负责本项目的统计学分析工作。近期发表论文：[1].查旭山,刘旖旎,李勇.中药含药血清对体外培养黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响.中国皮肤性病学杂志.2008,22(11):652-654.2、黄清华，女，1980年出生。2006年就读广州暨南大学医学院免疫学专业，并获得硕士学位。现在为广州医学院附属武警医院皮肤科医生。主要负责本项目分子生物学相关实验。近期发表论文：[1].李君武，黄清华，王珊.玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定.玉米科学.2009,5：28-31.已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决的途径本课题依托于广州医学院，广州医学院呼吸疾病实验室是广东地方高校中唯一一个国家重点实验室，“神经遗传与离子通道病重点实验室”是教育部与广东省共建重点实验室。另外拥有省级重点实验室2个、厅市级重点实验室12个。经过长期的相关研究积累，相关条件具备，已经有本研究所需的大型仪器：（略）五、经费预算项目金额（万元）合计6.01、科研业务费合计1.8（1）实验用动植物的购置、种植和养殖费0.1（2）计算、测试、分析费0.6（3）国内调研和学术会议费0.3（4）业务资料、报告、论文印刷费0.6（5）其他0.22、实验材料费合计3.0（1）原材料、试剂、药品等消耗性物品购置费2.2（2）标本、样品采集加工费0.2（3）运杂包装费0.1（4）其他0.56、劳务费0.97、管理费0.3谢谢