光合细菌转化槲寄生制剂乙醇提取浓度的研究

光合细菌转化槲寄生制剂乙醇提取浓度的研究【摘要】目的确定光合细菌（PSB）转化槲寄生制剂中槲寄生乙醇提取的最佳浓度。方法以荷Lewis肺癌小鼠为模型，以抑瘤率、免疫指标、抗氧化指标为标准进行筛选。结果PSB转化槲寄生制剂的各项指标均优于单纯的槲寄生制剂，其中以PSB转化槲寄生制剂Ⅱ的各项指标为最佳。结论槲寄生75％乙醇提取物所制光合细菌转化槲寄生制剂为最佳。【关键词】槲寄生；工艺学；光合细菌；抗肿瘤槲寄生为桑寄生科槲寄生属植物，文献［1，2］报道，槲寄生粗提物、槲寄生总生物碱具有抗肿瘤活性，但因其中含有对人体有害的毒肽和小分子蛋白质，限制了其应用。光合细菌（PSB）为一种有益菌，可以转化中药中的一部分成分。本文以荷Lewis肺癌小鼠为模型，以抑瘤率、免疫指标、抗氧化指标为标准对PSB转化槲寄生制剂中槲寄生乙醇提取浓度进行了筛选，报告如下。1材料与方法1．1材料1．1．1药材：槲寄生饮片，购自定州医药公司东亭批发部，经山西医科大学高建平博士鉴定为桑寄生科植物槲寄生［Viscumcoloratum（Kom．）Nakai］的干燥茎叶。1．1．2试剂与药品：环磷酰胺制剂（CP）：上海华联制药有限公司出品（批号0402061），临用前用生理盐水稀释到10mg/ml。PSB制剂：PSB系紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌（Rhodobactersphaeroides），由山西大学光合细菌研究室分离鉴定保藏，采用Ormerod培养基［3］，光照厌氧培养5d，浓缩得PSB制剂，菌液含菌数1．6×109个/ml；槲寄生制剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：分别为50％、75％、95％的槲寄生乙醇提取物，制剂浓度以槲寄生原药材计为0．5g/ml；PSB转化槲寄生制剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：分别由50％、75％、95％的乙醇槲寄生提取物，导入光合细菌后培养5d得PSB转化槲寄生制剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。制剂浓度以槲寄生原药材计为0．5g/ml，菌液含菌数1．6×109个/ml。1．1．3动物与瘤株：动物：C57/BL小鼠100只，雌雄各半，体质量（18.0±1．0）g，由山西医科大学动物中心提供。瘤株：Lewis肺癌，中国预防医学研究院提供，山西大学光合细菌研究室传代保种。1．2方法1．2．1瘤细胞接种：取新鲜无坏死的Lewis肺癌瘤组织，无菌条件下匀浆，制成单细胞悬液，于C57/BL小鼠每鼠右侧前腋窝皮下接种0．2ml。1．2．2分组与给药：接种后24h将动物按雌雄对半随机分成10组，每组10只。荷瘤对照组：生理盐水灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；培养基组：Ormerod培养基灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；环磷酰胺组：OptimallevelofethanolforextractionofMistletoepreparationstransformedbyphotosyntheticbacteriaQIXiao-mei*,ZHENGQing-hong,YANGGuan-e,ZHANGZhao-ming.*SchoolofPharmaceuticalSciences,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China【Abstract】ObjectiveTodeterminetheoptimallevelofethanolforextractionofmistletoepreparationstrans-formedbyphotosyntheticbacteria(PSB).MethodsThescreeningofethanollevelwasperformedusingmicemodelofLewis-lungtumorandbasedonthetumorinhibitionrate,immuneparametersandantioxidationparameters.ResultsAllparametersforPSBtransformedmistletoepreparationswerebetterthanthoseforuntransformedmistletoeprepara-tions.MistletoepreparationsⅡtransformedbyPSBshowedthemostfavorablevaluesofparameters.ConclusionPSBtransformedmistletoepreparationsextractedwith75%ethanolappearstobewithbestanti-tumoractivity.【Keywords】Visumalbum；Technology；Photosyntheticbacteria；Antitumor·1113·中国药物与临床2011年10月第11卷第10期ChineseRemedies&Clinics，October2011,Vol.11,No.10表1各组小鼠抑瘤率免疫指标抗氧化指标实验结果（x±s）瘤质量（g）抑瘤率（％）脾指数（mg/g）胸腺指数（mg/g）巨噬细胞吞噬功能A值SOD活性（U/mg肝组织）MDA活性（nmol/g肝组织）2．23±0．31—8．56±0．322．06±0．360．153±0．02614．10±0．85486±132．25±0．29－0．098．63±0．41c2．10±0．48d0．159±0．014d13．86±0．72c475±10c0．42±0．04a81．176．63±0．31a1．48±0．18b0．113±0．007b11．34±0．54a418±10a1．97±0．3611．6610．96±0．35ac2．36±0．29c0．336±0．018ac18．67±0．42ac316±11ac1．91±0．2714．219．02±0．24c2．24±0．31c0．256±0．035ac16．94±0．35ac362±10ac1．38±0．18b38．0910．12±0．40ac2．31±0．56c0．267±0．025ac18．14±0．51ac328±13ac1．87±0．2516．149．14±0．27bc2．16±0．12d0．243±0．031ac17．37±0．31ac326±12ac1．12±0．40a49．7811．41±0．31ac2．59±0．18c0．353±0．027ac20．16±0．24ac299±12ac1．97±0．3711．878．78±0．44c2．14±0．25d0．216±0．019ac15．32±0．22ac397±14ac1．37±0．17b38．409．63±0．36ac2．23±0．36d0．248±0．021ac16．34±0．43ac346±16ac--11．87±0．25ac2．74±0．16bc0．364±0．015ac22．05±0．28ac288±12ac注：与荷瘤对照组比较aP＜0．01，bP＜0．05；与环磷酰胺组比较cP＜0．01，dP＜0．05组别只数荷瘤对照组10培养基组10环磷酰胺组10PSB制剂组10槲寄生制剂Ⅰ组10PSB转化槲寄生制剂Ⅰ组10槲寄生制剂Ⅱ组10PSB转化槲寄生制剂Ⅱ组10槲寄生制剂Ⅲ组10PSB转化槲寄生制剂Ⅲ组10正常对照组10腹腔注射环磷酰胺，100mg/kg，共1次；PSB制剂组：PSB制剂灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；槲寄生制剂Ⅰ组：槲寄生制剂Ⅰ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；PSB转化槲寄生制剂Ⅰ组：PSB转化槲寄生制剂Ⅰ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；槲寄生制剂Ⅱ组：槲寄生制剂Ⅱ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；PSB转化槲寄生制剂Ⅱ组：PSB转化槲寄生制剂Ⅱ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；槲寄生制剂Ⅲ组：槲寄生制剂Ⅲ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；PSB转化槲寄生制剂Ⅲ组：PSB转化槲寄生制剂Ⅲ灌胃，每只0．4ml/d，连续15d；正常对照组生理盐水灌胃，每只0.4ml/d，连续15d。各组小鼠经下列不同处理15d后，进行下列各项实验。1．2．3抑瘤率的测定：荷瘤15d的小鼠停药后次日，称质量后脱颈处死，剥取瘤块称质量，按“抑瘤率＝（1－试验组瘤质量/生理盐水对照组瘤质量）×100％”公式计算抑瘤率。1．2．4免疫指标的测定：脾、胸腺指数的测定：取脾及胸腺称质量，计算脾及胸腺指数。脾指数＝脾质量（mg）/体质量（g）；胸腺指数＝胸腺质量（mg）/体质量（g）。腹腔巨噬细胞吞噬功能测定：采用中性红比色法测定各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力。1．2．5抗氧化指标测定：肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：采用邻苯三酚自氧化法测定各组小鼠肝脏的SOD酶活性。肝脏中过氧化脂质（LPO）的测定，即肝脏中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量测定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定各组小鼠肝脏的MDA含量。1．3统计学方法结果以x±s表示，以t检验比较组间差异。2结果2．1对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用：除培养基组外，其他各种制剂对于小鼠荷Lewis肺癌实体瘤均有一定的抑制作用。PSB转化的3种槲寄生制剂的抑瘤率与对应的单纯槲寄生制剂比较差异有统计学意义，其中以PSB转化槲寄生制剂Ⅱ抑瘤率最大（49．8％）；与荷瘤对照组比较，PSB转化槲寄生制剂Ⅰ组、Ⅲ组差异有统计学意义，PSB转化槲寄生制剂Ⅱ组差异有统计学意义，说明用PSB转化的槲寄生制剂对肿瘤的抑制效果比单纯槲寄生制剂好，但低于环磷酰胺对照组，且以75％乙醇提取物所制PSB转化槲寄生制剂Ⅱ抑瘤率最高，见表1。2．2免疫学指标：荷瘤对照组、培养基组、环磷酰胺组的脾指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能吸光度（A）值明显低于正常小鼠，说明荷瘤小鼠的免疫功能受到一定程度的抑制，环磷酰胺进一步降低其免疫功能；3种槲寄生制剂比对照组小鼠的免疫功能稍好，但效果不很明显；PSB和PSB转化的3种槲寄生制剂的脾指数、胸腺指数和巨噬细胞吞噬功能A值大大高于对照组，说明PSB制剂和PSB转化槲寄生制剂可以促进荷瘤小鼠免疫功能的提高，且以PSB转化槲寄生制剂Ⅱ为最好，见表1。2．3抗氧化指标：荷瘤对照组、培养基组的SOD活性明显低于正常小鼠，MDA活性明显高于正常小鼠，说明荷瘤小鼠肝脏清除氧自由基的能力比正常小鼠低。环磷酰胺组小鼠的SOD活性最低，MDA活性比较高，说明环磷酰胺可以降低荷瘤小鼠的抗氧化水平；3种槲寄生制剂、PSB制剂和PSB转化槲寄·1114·中国药物与临床2011年10月第11卷第10期ChineseRemedies&Clinics，October2011,Vol.11,No.10生制剂对于SOD活性的提高和MDA活性的降低有明显的作用，且以PSB转化槲寄生制剂Ⅱ为最好，见表1。3讨论增强机体的免疫功能及抗氧化功能对于肿瘤的预防和治疗具有重要的意义［4］。本文以荷Lewis肺癌小鼠为模型，以抑瘤率、免疫指标、抗氧化指标为标准对PSB转化槲寄生制剂中槲寄生醇提浓度进行了筛选。实验证明PSB转化槲寄生制剂对小鼠Lewis肺癌实体瘤的抑瘤率、免疫指标、抗氧化指标均优于单纯的槲寄生制剂，其中以PSB转化槲寄生制剂Ⅱ的各项指标为最佳，即槲寄生75％乙醇提取物所制转化制剂为最佳。前期动物实验表明，不同浓度的槲寄生醇提物中以75％醇提物毒性最大，其半数致死量（LD50）为42．735g/kg，PSB转化后在最大耐受范围内，未发现毒性反应；通过薄层色谱法（TLC）分析，PSB转化槲寄生制剂中成分与纯PSB制剂、纯槲寄生制剂中成分相比，发生了一定变化，且有2个以上主斑点，且不同浓度的醇提物制成的转化制剂各成分的量有所不同，其抗肿瘤的物质基础及详细机制需进一步研究。参考文献［1］SchumacherU，ValentinerU．Currentunderstandingofmistletoelectins．DrugDiscoveryToday，2003，8（1）：17－18．［2］BauerC，OppelT，PrzybillaB，etal．Ig