免疫组化SABC法与SV法的比较

博士德免疫组化SABC法与SV法的比较发布时间：2011-12-0822:38点击次数：186免疫组化SABC法与SV法的比较SABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）就是StreptAvidinBiotinComplex的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。基本原理：亲和素（Avidin）存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱性蛋白质，具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌（StreptomycesAvidinii）培养物中所提取的蛋白质，分子量47000，不含糖链，等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样，也有四个生物素结合位点，亲和力高达10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。生物素是一种水溶性维生素（即维生素H），分子量244。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用，这是SABC具有高度敏感性的基础。SV（SuperVision）两步法：是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强大的信号放大能力，同时有很强的组织细胞渗透力，经检测其灵敏度高于同类产品，特别是针对核抗原，其渗透性特别强，适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法比较具有简单，快速，高敏感，低背景等特点。原理示意图：用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物现对这两种方法进行比较：一．材料所选试剂：即用型SABC（过氧化物酶）试剂盒（博士德货号SA1021，SA1022）即用型SV（HRP辣根过氧化物酶）试剂盒（博士德货号SV0001，SV0002）DAB（黄色，博士德货号AR1022）Mayor`s苏木素（博士德货号AR0005）所选一抗：KCA3.1（BA1788）；PCNA（BM0104）；Vimentin（BM0135）注：抗体来源均为博士德公司所选组织片：乳腺癌石蜡切片，肠癌石蜡切片，切片厚度为5微米二．操作步骤SABC法：1.切片脱蜡至水2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟,灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次3.微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置５分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加5%BSA封闭液,37℃反应30分钟。甩去多余液体,不洗5.滴加一抗，4℃反应过夜。所配一抗的浓度为1µg/ml6.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加生物素化二抗IgG（抗兔或抗鼠）37℃反应30分钟7.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加试剂SABC，37℃反应30分钟，PBS洗3０分钟×3次8.DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤9.滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取出后洗涤，３７℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。SV法：1.切片脱蜡至水2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟，灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次3.微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置５分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加5%BSA封闭液，37℃反应30分钟。甩去多余液体，不洗5.滴加一抗，4℃反应过夜，所配一抗的浓度为1µg/ml6.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加HRP标记二抗IgG（抗兔或抗鼠）37℃反应30分钟，PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗30分钟×3次7.DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤8.滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取出后洗涤，３７℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。三.结果比较四．结论SABC法的特点：1.稳定性好：链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小。因此，SABC法在实际应用中，稳定性高，减少了操作误差，提高了检测的精确度2.特异性高：链酶亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度特异性。因此，SABC法的多级放大作用不仅可以提高检测的灵敏度，同时还避免了非特异性干扰3.高敏感性：生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成生物素衍生物结构，该结构具有保持大分子物质的原生物活性功能，同时，每个链酶亲和素分子有四个生物素结合部位，可以多价形式同时结合生物素化的大分子衍生物和酶标记物。因此，SABC法具有多级放大作用，使其在免疫组化实验时大大地提高检测方法的灵敏度SV法的特点：1.背景染色低：由于不用亲和素，避免了内源性生物素干扰，减少了假阳性、降低了背景染色2.操作简便快速：仅需进行两次抗体孵育，更为简单、快速3.核抗原染色强：多聚酶紧密连接在免疫球蛋白分子上，由于没有惰性多聚物骨架总体分子量相对较小，克服了大分子复合物穿透力弱、核抗原不易染色的缺点4.敏感性较高：显色结果可以达到比较满意的效果总结上述特点，SABC法与SV法各有优势，可根据自身的实验条件选取合适的实验方法