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免疫组化法在病毒学上的应用摘要:免疫组化法是将抗原抗体反应的专一性和显微形态学相结合，以研究组织或细胞中抗原定位的一种技术。在病毒学研究中，通过采用免疫组化技术可结合形态病变，快速、特异的检测各种病毒对组织细胞的感染并了解其致病机理。本文将结合实例对免疫组化法的原理和其发展以及在病毒学上应用的特点作简要介绍。关键词：免疫组化；病毒学；检测免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究的技术。具有特异性强、敏感度高、定位准确、形态与功能相结合的特点。免疫组化法在病毒学上有着广泛的应用。利用免疫组化法对受病毒感染的组织进行检测，可明确发现病原体抗原的部位并对其定位，从而了解病毒的存在及其感染机体后的分布情况。1.免疫组化法概述1.1基本原理免疫组化是目前生命科学研究中应用最广泛的方法，利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行抗体的定性、定位或定量的研究[1,2]。它将免疫学、组织学、生物化学等学科的理论和技术有机的结合起来[3]。免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。主要步骤为先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。1.2主要特点免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。1.3发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术标记铁蛋白Ab。70年代Stenberger改良上述技术，建立通过辣根过氧化物酶—抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。80年代Hsu等建立了抗卵白素—生物素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜检查与诊断技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深大医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。免疫组化的全过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体；标本的制备；免疫细胞化学反应以及呈色反应，观察结果[4-11]。在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白质，分子质量约为68,000,属于糖蛋白一类。当是命名为卵白素（Avidin）。卵白素具有4个由128个氨基酸组成的相同亚基，与生物素（又称维生素H）以及其他物质（例如荧光素和酶）具有很高的亲和力。卵白素在一般条件下性质稳定，可耐受80℃两分钟而保持其活性，当与生物素结合形成复合物后，性质就更稳定，可在很大的pH范围内以及对许多蛋白酶都有耐受能力。生物素（维生素H，Biotin）是Kogl等（1936）首先从鸡蛋黄中分离出来的。它还广泛分布于动植物组织中，并以辅酶的形式参与各种羟化酶反应。生物素为一种较小分子量的维生素，其分子量约为244，它与卵白素之间具有高度亲和力，较之抗原与抗体的亲和力高出100万倍，能够彼此牢固地结合而不影响彼此的生物学活性。由于卵白素和生物素之间具有高度的亲和性，生物素可与抗体偶联，不论生物素还是卵白素均能与过氧化物酶结合并不影响酶的活性，这样就将亲和化学和免疫细胞化学结合起来而形成卵白素—生物素免疫染色技术。卵白素—生物素过氧化酶复合物（Avidin-biotinperoxidasecomplex,ABC）技术是由1981年Hsu等在LAB和BRAB的基础上，改良进行建立的。现将卵白素和生物素偶联的过氧化酶按一定的比例组合成卵白素—生物素过氧化物酶复合物，从而保证卵白素有一定的游离结合点让生物素偶联物质结合。由于一个卵白素分子具有可与生物素结合的4个位点，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶结合，另一部分具有可与生物素标记的免疫球蛋白反应，生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白可以结合多个生物素分子，从而增强了免疫球蛋白或过氧化物酶结合卵白素的能力，这样卵白素就可以作为桥梁，把生物素抗体结合物及生物素酶结合物连接起来进而可能偶合更多的酶分子，并且这种相互作用的连接能形成一种较大的类似晶体的复合物，从而大大提高了酶染色的灵敏度。因此，ABC技术具有以下优势：敏感性强、特异性强、方法简便。由于生物素和卵白素具有和多种示踪物高度亲和的能力，可用于双重或多重免疫染色[12-15]。2.免疫组化法与病毒学的结合2.1基本方法免疫组化法在病毒学上主要用于检测病毒在组织中的分布情况，从免疫组化和病理角度观察实验组织和细胞结构，判断是否有所检测的病毒存在。主要过程包括抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体。如用于病毒病临床检测及流行病学调查需选取临床诊断为病毒病，并且经血清学检查该病毒抗体为阳性的病例的组织病料。如需通过实验动物人工诱发病毒病，则应选用清洁级或SPF动物进行病毒的接种，记录动物感染后的发病情况并剖检观察病毒感染导致的器官和组织病变情况。采集来的组织病料经固定、脱水、包埋、切片处理，再进行免疫细胞化学反应以及呈色反应，观察结果。2.2免疫组化法染色切片镜检实例（见图1[16]，2[17]）3.免疫组化法应用于病毒检测的评价免疫组化法技术具有特异性强、敏感度高、定位准确、形态与功能相结合等特点。与免疫荧光技术和电子显微镜技术相比较具有其独特的优势。免疫荧光技术中荧光容易消退，非特异性荧光的结果常影响结果的判断，而且必须借助荧光显微镜才能观察结果。而电镜设备昂贵复杂且批量处理能力有限。免疫组化法除具有操作简便、结果准确的优点外，还可结合病理学诊断技术研究病毒在体内的感染途径、扩散方式和存在部位，动态的了解病毒病的病原及致病机理，这对病毒检测等具有非常重要的意义。随着免疫组化法的不断成熟和技术的进步，其在病毒学研究中将会有越来越广阔的应用空间。图1人肝细胞中HCV免疫组化染色HCV阳性反应定位于肝细胞胞浆一侧，细胞核为阴性。图2SD大鼠肝脏HBV和HEV免疫组化染色（×40）A.HBcAg，肝细胞普遍呈阳性反应；B.HBcAg，被膜下阳性反应细胞核；C.HBsAg肝细胞普遍呈阳性反应；D.HBsAg被膜下阳性反应细胞核和包膜；E.HEV，肝细胞普遍呈阳性反应；F.HEV，被膜下阳性反应细胞核；G.HEV，肝脏汇管区的阳性反应；H.HEV，肝小叶中央区的阳性反应；I.阴性对照参考文献[1]马贵平，李冰玲，田海燕，刘来福免疫细胞化学法检测牛脑组织中BSE病原[J].动物医学进展，2002,23(2):33-36.[2]Shan-RongShi,RichardCote,J,ClIveR.Taylor,AntigenRetrievalImmunohistoche-mistey:Past,PresentandFuture[J].TheJournalofHistochemistryandCytochemsitry,1997,45(3):327-343.[3]张静;新城疫病毒的分离鉴定和免疫组化法检测的研究[D];安徽农业大学;2008.[4]沈卓民.实用组织学技术[M].北京:人民卫生出版社,1998.[5]孟庆媛,刘东璞,郭梦凡,林明华,王抒.免疫组织化学染色技术实际应用体会[J].黑龙江医药科学,2006,(1):82-83.[6]刘复生.免疫组织化学[J].癌症进展,2004,(3):46-48.[7]黄晓赤，罗克枢.免疫组织技术的临床应用概况[J]，中华病理学杂志，2003,29(5):310-313.[8]罗伟,王廷华,赵匡彦.Ⅰ抗孵育时间对免疫组织化学实验结果的影响[J].四川解剖学杂志,2004,12(2):100-101.[9]毕晓芳,陈利萍,方虹.不同抗原修复方法对免疫组化染色结果的影响[J].宁夏医学杂志,2006,28(01):50-51.[10]骆新兰，蔡秀珍，刘艳辉.不同的抗原修复条件对免疫组织化学染色结果的影响[J].中华病理学杂志,2005,34(7):52-54.[11]周晓鸽,王鹏,陆鸣.加热抗原修复对内源性生物素蛋白结合物的影响及其对策[J].中华病理学杂志,2002,31(9):491-496.[12]倪灿荣,戴益民.防止免疫组化染色中脱片的方法和使用体会[J].临床与实验病理学杂志,1989,5(3):183-184.[13]孟如松,施华强.免疫组化技术背景的非特异性着色[J].空军总医院学报,1989,5(3):171-172.[14]李维华.免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用[J].人民军医,1997,40(10):612.[15]同济医科大学及中山医科大学病理学教研室.外科病理学(上册)(第2版)[M].武汉:湖北科学技术出版社,1999.339.[16]黄进,周晓军,张太和;丙型肝炎病毒的免疫组化检测技术[J];江苏医药;1994年09期.[17]于品;佘锐萍;夏抗抗;李文贵;丁叶;岳卓;韩德平;;免疫组化法检测大鼠肝脏组织中的乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒[J];中国动物检疫;2010年09期.ImmunohistochemicalmethodintheapplicationofvirologyStudent:NiXintao(072001221)Abstact:Immunohistochemicalmethodisakindoftechnologythatcombinesthespecificityofthetigenantibodyresponseandthemicromorphologicaltoresearchorganizationorcellpositioning.Invirologystudy,immunohistochemicaltechniquescanbecombinedwithformlesions,rapid,specificdetectionofvariousvirusinfectionofcellsandthepathogenesismechanismcanalsobeunderstoodbythismethod.Thispaperwillgiveabrie