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免疫组织化学考题2004级考题1.简述原位杂交组织化学的基本原理。P842.简述免疫组化染色ABC法的基本原理。P523.组织块进行固定的原理是什么?常用的固定方法和固定剂有哪些?P104.何为细胞培养术?举例说明其在生物学医学研究中的应用.5.细胞凋亡的形态学检测方法有哪些?6.何为色温?在显微摄影中常用日光型胶片在灯光下拍照,您将用何种方法调节色温?P1847.何为像素？在数码摄影中常考虑的参数是什么？P136;P1988.酶标抗体免疫细胞化学间接法的基本原理是什么？此法的优缺点是什么？按此方法选择抗体时应注意什么问题？P519.结合本专业的研究方向，自行设计一个双重免疫荧光细胞化学染色的实验，并写出实验流程，简述免疫荧光细胞化学染色中的注意事项。10.学过此门课程后有何感想？为使此课程开设的更好，请留下您宝贵的意见和建议。2007级考题1.简述形态学研究有哪些主要常用技术？这些技术能解决哪些问题？2.试述石蜡切片和HE染色的基本制备过程，并指出制备免疫组化的石蜡切片和用于HE染色的石蜡切片有何不同。P11;P207;P2083.上课留的作业4.何谓免疫荧光染色，用何种方法消除非特异荧光？P44;P745.ANNVASSAY检测细胞凋亡的原理、试验流程和结果分析。答：原理：主要是根据细胞凋亡过程中的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36KD的钙离子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，还会加一种DNA染料，常用的有P1。由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。试验流程：1）细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打。凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02%的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1-5）×106，500~1000r/min离心5min弃去培养液。2）用孵育缓冲液洗1次，500~1000r/min离心5min。3）用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。4）500~1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。5）加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，上机检测。6）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm透带滤器检测FTTC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测P1。结果分析：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如P1有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被P1着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期P1不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。6.何谓像素？简述数码相机摄影的基本原理。P1987.影响曝光的因素有哪些？什么情况下使用光圈优先？什么情况下使用快门优先？什么情况下考虑胶片的感光度或相当感光度？P1808.谈谈你学习这门课的感想和体会？并提出对这门课的建议。作业：设计一个自己研究领域的小实验（方法要有免疫组化技术）要求：1.要解决的问题2.技术必须有免疫组化技术3.预实验结果1.简述广义的组织化学均包含那些主要采用技术？这些技术能解决科研中的哪些问题？广义的组织化学包括传统的组织化学，免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和原位杂交组织化学。组织化学用于检测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。免疫组织化学由于特异性强敏感度高所以应用广泛，凡是组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质，多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测，因此成为生物医学各学科领域的重要研究手段。电镜组织化学主要用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位虽然目前已知酶的种类超过2200余种蛋电镜只能观察100种，其原理是酶组织化学反应过程，酶底物反应的特异性，捕捉反映（金属盐城点发嗜锇性物质生成法。免疫电镜是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用电子密度标记抗体或经免疫化学反应能产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性定位的一种技术。更多用于定位细胞内mrna它可为研究单一细胞中编码各种蛋白质和多肽（前体）的相应MRNA定位以及研究细胞内基因表达有关因素的调控提供有效地手段另外像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域2.试述石蜡切片和HE染色基本制备过程？并指出制备免疫组织石蜡切片和HE染色的石蜡切片有何不同？石蜡切片基本制备：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏。取材：材料的好坏直接影响到切片的质量，取材时给定位麻醉药量适中，去组织是尽可能不损伤所需部位取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。固定：常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。固定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。3．脱水生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。4．透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。20甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明。5．透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。6．切片（1）石蜡块的固着与整修在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。（2）切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚