生化工程第二章培养基灭菌

生化工程第二章培养基灭菌本章主要内容第一节分批灭菌第二节连续灭菌培养基灭菌程度N/N0•培养基灭菌程度的要求因发酵系统而异。某些培养过程，由于培养基中的基质不易被一般微生物利用,或温度、pH不适于一般微生物的生长，则对无菌程度要求低；但是有一些培养过程对无菌程度要求高，例如抗生素的生产过程。第一节分批灭菌•一、微生物的热死灭动力学对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。NkdtdNln(N/N0)=-Kt均相系统，它符合化学反应的一级反应动力学。K（比热死亡速率常数）由两个因素均定1、微生物的种类2、灭菌温度。RTEeAK/RTEeAKd/''RTEeAKd/''cKddtdcRTEeAK/NkdtdNln(N/N0)=-Ktln(C/C0)=-Kdt杂菌营养物质△T，△K，△Kd也就是K对T的变化率是怎么样的？灭菌动力学的重要结论细菌孢子热死灭反应的△E很高，而大部分营养物质热破坏反应的△E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)=-Kt）；由于营养成分热破坏的△E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。第一节分批灭菌二分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行灭菌，也称实罐灭菌。优点：（1）不需专门的灭菌设备。（2）对蒸汽的压力要求较低，在3～4×105Pa（表压）就可满足要求。缺点：在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。第一节分批灭菌二分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作高压蒸汽锅第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•2、分批灭菌的设计•要求绝对的无菌在工业上很难做到，•因为：KtNoNlnktNoeNN=0，则e-kt=0,1/ekt=0,ekt=∞,t=∞因此，绝对的无菌很难做到。第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•而且绝对的无菌也是不必要的，工程上只要求培养基中杂菌降低到合理的程度，然后进行细胞的培养，失败的可能性很小。•那么无菌程度降低到多少为好呢？•有一个设计标准（判据）NoNN0：未灭菌培养基的含菌数。N：灭菌后培养基中存活的菌体数，第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•常取N=10-3个/罐。•它的意义是：灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。•例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐NoN1665310/1010010/10罐个罐个=那么为计算方便Ln（N0/N）=36.8第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0Ln(N0/N1)Ln(N2/N)Ln(N1/N2)LnN0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的ln（N0/N）=ln（××）1NNo21NNNN2NN221NN1NNolnN0/N=ln+ln+ln第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•在灭菌过程中，必需设计出灭菌过程的操作时间和温度。•首先根据培养过程对培养基无菌程度的要求提出无菌判据（ln），然后依据所使用的灭菌设备，和设计出的灭菌温度和时间来计算出实际的ln，看能否达到开始提出的无菌要求。NoNNoN•ln(N0/N1)=K(t1-t0)•K是变数，t变化，T变化，K也变化。NKdtdNdtKNdN10/101lnttRTEttdtAeKdtNNo升温段：T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)ln(N1/N2)T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)保温段：Ln(N1/N2)=K(t2-t1)T一定，K是常数。ln(N1/N2)32/32lnttRTEdteANN降温段：这三个判据中，保温段可以算出，升温段和降温段不好办，因为不知道T和t之间的函数关系。•是否有这样的函数关系呢？•一些学者已经作出的常用的换热方式T-t关系式。•除了这种积分方式以外，工程上还常用图解积分法，即从设计的T-t数据换算成K-t数据，进行图解积分。第一节分批灭菌二分批灭菌的设计第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•例如：某发酵罐分批灭菌最高温度120℃，保持5min，设计的温度和时间关系如下：•（A=7.94×1038min-1；△E=278441J/mol;R=8.28J/mol·K）t0103036435055586370102120140T30509010011012012011010090604433K0000.030.363.593.590.360.03000t：min,T:℃,K:min-1,发酵罐60m3，N0=105个/ml，N=10-3问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•解：先计算无菌程度的判据：•N0/N=6×1015•ln(N0/N)=36.3•K的数据值是由已知数据计算出的•根据已有的数据作出T-t和K-t图36510106010RTEeAK/ln(N0/N3)=ln(N0/N1)+ln(N1/N2)+ln(N2/N3)=36.3ln(N1/N2)=K·△t=3.59×5=17.95第一节分批灭菌二分批灭菌的设计•ln(N0/N1)+ln(N2/N3)按图解积分，求得:•ln(N0/N1)+ln(N2/N3)=15.85•ln(N0/N3)=•t=34min以前和t=64min以后，K值太小，忽略不计.•没有达到N3=10-3的要求,•残留菌数N3=N0e-Kt=N0e-33.8=1.26×10-28.336434Kdt第一节分批灭菌二分批灭菌的设计保温阶段对杀死孢子的贡献:17.95/33.8=53%，而保温阶段时间只有5min。那么如何改进设计呢？(1)增加保温时间，如果增加1min,那么ln(N1/N2)=3.59×6=21.54那么ln(N0/N3)=21.54+15.85=38.39，达到了设计要求。(2)可以提高灭菌温度。间歇灭菌的提温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小，而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。第二节连续灭菌•一、连续灭菌方法•第二节连续灭菌一、连续灭菌方法•与间歇灭菌相比，连续灭菌的优点：•1升温和降温速度快•2灭菌温度高，保温时间短•3蒸汽用量平稳•缺点：•1设备复杂，投资大。第二节连续灭菌一、连续灭菌方法•空罐灭菌•加热器、维持罐和冷却器也先进行灭菌。•耐热性物料和不耐热性物料可分开灭菌。•糖和氮源分开灭菌。第二节连续灭菌•二、连续灭菌反应器的流体流动模型τ=式中：反应器中液体所占的体积（L，m3）Q：通过反应器的流体流速（L/min，m3/min）在设计连续灭菌设备时，必须认识到并不是培养基的每一质点都在反应器中停留同样的时间。QVV活塞流（理想）滞流，V=0.82Vmax湍流,V=0.5Vmax实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布）。第二节连续灭菌•实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布），这就必然造成物料间的（轴向）混合，这样就不能保证物料先进的先出，后进的后出，那么有的物料灭菌时间长，有的灭菌时间短，有的物料达到了灭菌要求，而有的没有达到，由此我们在设计反应器时，一定考虑到这个现象，引入的τ概念。第二节连续灭菌•返混现象：•反应器中停留时间不同的物料之间的混合称为返混。•按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型。•连续搅拌罐（CSTR）和活塞流反应器（PFR）反应器返混为∞返混为零第二节连续灭菌•在实际反应器中，其返混程度总是处于两种模型之间。搅拌良好的反应器接近于CSTR，管式反应器和填充床反应器返混程度较小，接近于PFR反应器。•这两种模型都可用于培养基灭菌以及微生物的培养。第二节连续灭菌（1）PFR模型（活塞流）plugflowreactor物料沿同一方向以相同速度向前流动，在流动方向上没有物料返混，所有物料在反应器中的停留时间都是相同的。（长径比很大的管式反应器，没有弯头、阀门、管件、接近于PFR模型）第二节连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactor恒温热灭菌状况：1同一截面上活孢子浓度（N）相等，热死灭速率相等。2沿流动的方向，活孢子浓度（N）下降，热死灭速率也相应下降。NkdtdN第二节连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactor•求算N、t、L的数学关系•方法：对反应器进行物料衡算。•培养液通过PFR全反应器所达到的灭菌程度的计算：•先对微元物料衡算，再沿流动方向的长度积分。•物料衡算通式：•进入量=排出量+反应量+积累量dv足够小，可以认为在此微元内N相等，热死灭速率处处相等，是均一体系。QN=Q（N+dN）+KNAdl+0A为横截面积整理得：QdN=-KNAdlKNdtdN第二节连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plugflowreactorQdN=-KNAdl∵dtAdlQ1LNNdLQKANdN00∴KNdtdN，积分KtNoNln结论：活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分批灭菌效果相同。KtNoNlnKNdtdN第二节连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）ContinuedflowStirredTankReactor连续搅拌罐反应器的结构基本上与间歇操作的搅拌罐反应器相同。•两者的根本差别在于：•1连续操作。•2反应器内料液组成（等于出料液组成），不随时间而变化。•搅拌强烈的实际连续反应器（机械搅拌、气流或液流搅拌）可以接近于CSTR特性。第二节连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）•求算N、t、V的数学关系•方法：对整个反应器进行物料衡算。•物料衡算通式：•进入量=排出量+反应量+积累量•QN0=QN+K·N·V+0•整理QN0=N（Q+K·V）QN0=N（Q+K·V）NoNKVQQ第二节连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）NoNQVK11NoNKt11第二节连续灭菌CSTR和PFR灭菌效果的比较NoNKt11PFR:NoNe-kt=要达到相同的灭菌效果，即需要的灭菌时间长？NoN一定，那么哪一种反应器结论：CSTR需要的时间长。CSTR：第二节连续灭菌（3）多级全混流釜模型MultipleCSTRsinseries•在工程实践中常将几个CSTR反应器串联使用，来接近PFR的效果。tN0活塞流多釜串联多级全混流釜串联模型及其浓度分布图MultipleCSTRsinseries'1111KNoN'11122KNNnKNoN)1(1τ为每个串联反应器的平均停留时间。如果让多级全混流釜模型有PFR效果，则：nKNoN)1(1Kte1=t=nτ，∴（1+Kτ）n=ekτn当τ=0，n=∞时，有活塞流的效果。第二节连续灭菌（4）扩散模型返混：是不同反应时间的物料之间的混合。PFR：返混程度最小CSTR：返混程度最大高/径↑，返混程度↓高/径↓，返混程度↑实际操作的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间。•返混是个复杂的现象，到目前为止还不能用数学解析的方法表示出来，在实际的工程中，又要涉及到这个问题，怎么办？•把这个复杂的现象用数学模型表示，使简单的模型和复杂的系统具有等效性。•扩散模型•活塞流•扩散流动•流体在管内流动，由于分子扩散和涡流扩散的作用使一部分流体质点返混了回去，这个过程简化为在活塞流动中叠加了一个与流动方向相反的扩散。费克定律：扩散通量（沿