Biacore-X100简易操作指南

BiacoreX100简易操作指南一、BiacoreX100设备介绍分子相互作用分析系统Biacore是由仪器主机和电脑两部分组成。仪器开关在主机右后方，仪器正面左侧为缓冲液入口，可放置运行缓冲液，中上部分为状态面板，以指示灯显示仪器状态，状态面板右边即为芯片的放置位置，芯片会与SPR光学检测器、微流控系统IFC嵌合，开展结合分析过程。右侧为样品舱，可放置15个1.5ml的EP管，下方放有废液瓶。如下图所示。二、实验准备实验前需根据实验需求选择芯片，GE提供羧基葡聚糖表面的CM系列芯片、适用于HIS标签蛋白的NTA芯片、应用于生物素标记分子的SA芯片（通常用于核酸、多肽）等，蛋白研究最常用CM5芯片，开展实验时会固定一个分子（配体）在芯片表面，另一个分子（分析物）以流动相流过芯片，通过表面等离子共振SPR的原理研究相互作用的过程。根据实验目的，需要确定配体的偶联量，可通过以下公式进行计算，其中Rmax代表芯片的最大结合容量，为分析物在表面的最大响应值，Sm为化学计量比，LigandMW为配体的分子量，AnalyteMW为分析物的分子量，RL代表配体的偶联水平，也即需要求得的值，实际固定量一般设为1.5RL。动力学分析中，Rmax需低于100RU。Biacore对分子的互作检测是基于功能性的，所以实验过程必须要新鲜有活性的样品，0.22um膜过滤或者仔细离心，配体纯度要求在90%以上，分析物的纯度依实验类型而定，进行动力学/亲和力分析时需要90%以上的纯度，进行浓度/特异性测定时可以进混合样品。缓冲体系选择：大多数缓冲液均适用，可根据样品活性确定最适缓冲液，须新鲜配制，经0.22um膜过滤及脱气。氨基偶联方法固定配体时，缓冲液中不能含有Tris、甘氨酸等带有伯胺基的物质。分析物溶液中，不能含甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质，如果样品中含有该物质，可通过缓冲液置换、透析的方法除去。三、实验操作在该部分中，选用CM5芯片，以配体mouse-anti-humanβ2-microglobulinantibody和分析物humanβ2-microglobulin的动力学分析为例进行操作介绍（样品均来自Biacoregettingstartedkit），实验流程为配体固定-表面测试-再生条件筛选-分析物进样-芯片再生-数据分析。首先将缓冲液更换为实验所用缓冲液HBS-EP+，芯片更换为CM5芯片，选择Tools-undockchip，填入芯片信息，按照芯片表面箭头所指方向，将芯片放入并合上舱门，点击dockchip。缓冲液、芯片放置完毕，选择Tools-prime进行缓冲体系更换。1、pHscouting：在CM5芯片上固定配体之前，需要筛选合适的配体缓冲液pH，使配体通过静电吸附的作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果，通常会从pH5.5，5.0，4.5，4的10mM醋酸钠中筛选，一般配体浓度为10-100ug/ml，初次实验可尝试20ug/ml。选择Assayflow-wizard，surfacepreparation-immobilizationpHscouting，单击New，可设置过程参数。首先选择芯片通道，可从1,2,3,4通道任选一个，buffer已经预置四种条件，10mM醋酸钠，pH5.5,5.0,4.5,4，单击Next，输入配体名称mouse-anti-humanβ2-microglobulinantibody，contacttime180s，流速5ul/min，之后用50mMNaOH再生表面，单击Next，可进行芯片表面温度和样品舱温度的设置，单击Next，左侧选择sampleandreagentrack1，按照样品架中对应位置放置溶液即可，点击Next保存实验方法，即可开始实验。2、配体固定：配体在表面的偶联有直接偶联法和捕获法，本实验中使用氨基直接偶联的方法进行固定。选择Assayflow-wizard，surfacepreparation-immobilization，单击New，芯片选择CM5，可对FC1、2、3、4四通道分别设置，一般1，2通道配对使用（1通道作为参比），3，4通道配对使用（3通道作为参比），参比通道可用空白对比或活化-封闭无配体固定的方式，实验用通道1和2，通道2上偶联配体。直接的共价偶联方式有氨基、巯基或醛基等方法可选，最常用氨基偶联，一般流程是先用EDC/NHS活化，固定配体，再用乙醇胺封闭。偶联模式有aimforimmobilizedlevel和specifycontacttime两种，aimforimmobilizedlevel只需输入目标偶联水平，软件会自动实现相应水平的偶联，contacttime模式需要输入进样时间和流速，一般在一定的预实验基础上使用。本实验为动力学分析过程，Rmax要低于100RU，所以1.5RL计算出来为1000RU左右，直接使用aimforimmobilizedlevel模式，输入targetlevel1000RU，进行自动偶联。Next之后的步骤同上，进行实验过程的参数设置。偶联结束后，通过Responsebound进行偶联量的检测。3、表面测试：选择AssayFlow-Manualrun，flowpath选择1-2通道串联，在referencesubtraction选择2-1，点击Start。分别配制浓度为85nM，8.5nM，0.85nM的β2micro-globulin溶液，glycine-HCl再生溶液，均放到样品架上。点击Sampleinjection的图标，选择某一浓度样品的对应位置，contacttime设为180s，点击wait图标，waittime设为60s，点击regenerationinjection图标，选择再生溶液的对应位置，contacttime设为30s，重复设置好三个样品的表面测试-再生流程。注意分析物要用运行缓冲液稀释。表面测试结果中，可通过通道2对通道1扣减的传感图结果考察分析物和配体是否有结合，进样解离时间是否合适，预估KD值等，其中KD值预估是基于分析物在表面的响应值与Rmax值进行的比较和判断。通过通道1的响应值判断分析物和芯片表面是否有非特异性结合。4、再生条件选择：要求将分析物全部洗掉并不损失配体活性，也即再生之后传感曲线能够回到结合之前的基线水平，并且表面对分析物的结合能力没有太大下降（理想的结合水平变化在10%以内），常用不同pH的Glycine-HCl，高盐或酸碱溶液进行再生。可通过wizard-assaydevelopment-regenerationscouting，New进行再生条件筛选。flowpath选择1-2通道串联，芯片选CM5，点击Next，startup是在正式运行前对芯片状态调整热身，一般做3次以上，点击Next，输入分析物的名称：β2micro-globulin，Next，再生溶液流速设为30ul/min，Numberofconditions是指再生条件的个数，numberofcycles指每种再生条件重复实验的次数，一般lockcontacttime进行再生效果比较。以下设置相同。5、根据之前的实验结果设置合理的分析物浓度梯度，一般在0.1KD-10KD之间，进行动力学的检测，KD值是通过表面测试环节进行的预估。在Assayflow内选择Kinetics/Affinity，单击New，flowpath选择2-1，CM5chip，点击Next，startup循环的solution为buffer，数量选3次，点击Next，sample输入进样时间和流速，regenerationsolution按照之前的再生条件输入，glycine-HCl2.5，点击Next，输入样品信息，样品名beta2micro，MW11.8kDa，浓度梯度为0nM，2nM，4nM，8nM，16nM，32nM，8nM，有零浓度和一个样品浓度的重复。对于动力学分析，Rmax值低于100RU。四、系统维护取出检测芯片，换成维护芯片，使用足够的新鲜纯水更换运行缓冲液，prime冲洗系统，prime之后，系统会自动切换到standby模式，清洗废液瓶，更换洗针用水。每周执行desorb，可以将系统和管路内沉积的盐清洗干净，缓冲液为MilliQ水，放入维护芯片，在Tools-Moretools内，点击maintenance下的desorb，点击start。Desorb会用到desorbsolution1（0.5%SDS，室温保存！）和desorbsolution2。每月执行desorbandsanitize，sanitize主要目的是除菌，防止管路中微生物生长，在Tools-Moretools内，点击maintenance下的desorbandsanitize，会用到desorbsolution1、desorbsolution2和BIAdisnfectantsolution。若超过7天不使用，在Tools里选择Shutdown，执行关机操作，按照提示进行MilliQ水清洗，70%乙醇清洗，排空管路，最后关机。芯片保存可用干法、湿法或者半干法保存。干法即直接取出芯片后4度保存，湿法是将芯片浸入缓冲液中4度保存，放入仪器之前需将缓冲液甩干，半干法也即下图中演示的方法，只在金膜区域滴加溶液，4度保存即可。