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第六章体外分析技术体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称，它是利用某种特异性结合剂与被测物和标记物进行结合反应，从而对极微量物质进行定量分析的分析技术。1960年Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法（RIA）测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定的新时代，是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例介绍这类方法的基本原理及方法特点。第一节放射免疫分析一、基本原理：放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类技术，其基本原理为竞争性抑制。即：放射性标记抗原和非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）共同与特异性抗体发生可逆性结合，如图8-1。这种竞争可用以下反应式来表达：Ag+Ab→AgAb+Ag*↓Ag*Ab式中Ag*代表标记抗原，Ag代表非标记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag*Ab代表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标记抗原抗体复合物。当反应体系中同时存在Ag、Ag*和Ab，而Ag*的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗原）时，随着Ag的增加，Ag*Ab的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量效应曲线（calibrationcurve），也称标准曲线。试剂盒组成：（以T4测定为例）1、Ag(系列标准品)，浓度分别为：0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*，125I-T4（红色，作为示踪剂）3、Ab，抗T4抗体（作为结合剂）4、分离剂（免疫分离剂，结合反应达到平衡后将结合部分与游离部分分开）0204080160320待1待2加样：1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管2、Ag*200ul/每管3、Ab100ul/每管混匀，37℃45分钟，加分离剂离心，测定结合部分放射性。放射免疫分析的几种标准曲线图：抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律，即：当反应达到平衡时，k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结合常数，也称亲和常数，则有：k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示，B+F=1），可以推导出B的函数式，由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。对每一特定的RIA系统，[Ab0]和KA是固定的，[*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐标上随非标记[Ag0]呈双曲线走向。二、基本试剂（一）、抗体（antibody）(1)、抗体的制备：抗体是体外放射分析中应用最广的结合剂，是用纯化的免疫原免疫动物制备而得，免疫的成败在于免疫原和动物种类以及注射途径、佐剂的使用、注射剂量和时间等。分子量超过5000的蛋白多肽物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体形成。分子量小于5000的肽类物质免疫原性低，需要与载体蛋白结合方能引起明显的抗体形成。应该指出，动物对抗原的免疫反应个体差异很大，当一批动物用同样的免疫原和免疫程序进行免疫时，往往只有部分动物产生满意的反应。（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定：评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和亲和力。1）滴度测定：测定方法是将抗血清稀释成不同浓度，分别加入一定量的标记抗原，在适当的反应条件下达到平衡后，分离B与F，计算不同稀释度的抗血清与标记抗原的结合百分率，以结合百分率为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，绘制抗血清稀释曲线（如图）。选择结合率为50%时所对应的稀释度，作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。抗体滴度越高表明抗体的质量越好。2）特异性测定：抗血清的特异性是指抗体与待测物以外的结构类似物结合的程度（又称交叉反应率）。交叉反应百分率=[Y]50/[Z]50×100%其中[Y]50为被测物结合率50%时的浓度值；[Z]50为结构类似物结合率50%时的浓度值。干扰轻者特异性高。3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表示特定的抗原、抗体之间的结合能力，常用亲和常数KA来表示。KA越大，表示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F值大，方法的灵敏度高。随着单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）技术的发展，提高了现代体外分析技术的特异性和亲和力。（二）、放射性标记物放射性标记物是体外放射分析的测量依据，常用的标记核素有125I和3H。对标记物的质量要求包括：（1）比活度（specificactivity）：体外放射分析法的定量范围一般在10-9-10-12mol水平，标记物的用量应等于或小于被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。（2）放化纯度（radiochemicalpurity）：一般要求标记物的放化纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。（3）免疫活性（immuneactivity）：标记物在标记和储存等过程中会造成损伤，使标记抗原的免疫活性下降，与抗体发生反应的能力减弱，甚至丧失，因此抗原活性的检测十分重要。要求标记抗原与待测抗原具有相同的免疫活性。（4）稳定性（stability）：稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。许多因素可影响其性能的稳定性，如标记方法、标记位置、置换水平、理化环境等都可使放射性核素从标记抗原的分子上脱落下来，或造成标记分子聚合或解离，使放化纯度明显下降。当标记方法合理，保存条件完善时，货架期可达1-3月。（三）、标准品（calibrationstandard）标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化会直接影响样品的测定值。对标准品的要求包括：（1）标准品与待测物质应属同一物质；（2）在与结合剂发生反应时，应与待测配体有相等的活性和亲和力；（3）高度纯化，不含影响分析的杂质；（4）标准品的定量一定要准确。四、分离技术在放免分析中，当抗原、抗体反应达到平衡后，必须将B与F分离，分别测定其放射性。理想的分离技术应兼备以下几点：（1）将B与F尽可能完全分离，并且不改变最初的平衡状态；（2）B与F的分离不易受血浆或血清等外界因素的干扰；（3）分离试剂廉价易得，操作简便、分离迅速、重复性好。几种常用的分离技术介绍如下：（一）沉淀法（precipitationmethod）也称PEG法。溶解于水中的蛋白质，其分子周围有水化层，以此保持蛋白质在水中的稳定性，蛋白质分子吸水能力的大小取决于蛋白质分子电荷的多少。在一般RIA中，反应体系PH值多为中性附近，接近蛋白质的等电点，γ球蛋白所带的电荷很少，形成水化层的能力较弱，当加入适当浓度的聚乙二醇或碱金属中性盐如硫酸胺等夺取其周围的水分子，使它失去水化层，从而将抗体γ球蛋白（B）沉淀下来，与游离部分的抗原分离。这种分离方法的优点是操作简便，分离迅速，价格低廉，但是，这种方法易受环境温度（温度高于30℃时沉淀物容易复溶）、pH值、离子强度和蛋白质含量(最终浓度达250mg/ml以上)及分子量(蛋白质分子量越大，用以沉淀的PEG浓度越小)的影响，并且有些抗原也可能被同时沉淀下来，所以，非特异性结合高。（二）双抗体法（doubleantibodymethod）在RIA中，当抗原、抗体反应达到平衡后，由于抗原抗体复合物的浓度很低，而且处于可溶性状态，不能直接通过离心的方法加以分离。于反应体系中加入第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体复合物，通过离心将B与F分离开来。双抗体法为一种特异性的分离方法，非特异性结合低，但主要缺点是分离时间长，第二抗体用量多等。AgAb1Ab2Ag·Ab1Ab1·Ab2Ag·Ab1·Ab2（三）双抗体-PEG法（doubleantibody-PEGmethod）这种方法是目前被广泛采用的一种方法，它兼顾了双抗体法和PEG法各自的优点，克服了双抗法分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点，并且使第二抗体和PEG的用量大为减少，在常温加入分离剂后，无需温育，直接离心，可获得满意的结果。（四）吸附分离法（adsorptiveseparationmethod）应用经过特殊处理的吸附剂，将游离的小分子抗原或半抗原吸附，经过离心，随着吸附剂的沉淀，将F沉淀下来，而抗原-抗体复合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，从而将B与F分离开。常用的吸附剂有葡聚糖包被的活性炭（DCC），离子交换树脂等。（五）固相分离法这种分离法是将抗原或抗体通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的抗原-抗体复合物，可与游离部分分离。固相分离技术的方法较多，比如，试管固相法：将抗体IgG直接包被于试管底部，使用时将非标记抗原和标记抗原加入试管，抗原与包被在管底的抗体结合达到平衡後，弃去上清（F），洗涤后测定反应管（B）的放射性即可。固相分离技术的主要优点是操作简便、迅速，分离效果好，非特异性结合低，是一种比较有前途的分离方法。（六）磁化分离技术（magnetizingseparationtechnique）磁化分离法是将磁化材料引入RIA体系，当反应达到平衡后，借助磁力将B与F分离，从而省去了离心的步骤。（七）微孔滤膜法（milliporefiltermethod）微孔滤膜法通常采用醋酸纤维素滤膜或玻璃纤维素滤膜，在放免反应达到平衡后，将反应液加入装有微孔滤膜的滤器上，抗原抗体复合物保留在滤膜上，游离部分被滤掉。五、数据处理（标准曲线拟合）RIA的数据处理是以标准品的检测结果为依据，拟合出标准曲线，再通过标准曲线求出待测样品的浓度值，标准曲线是衡量样品的客观尺度。标准曲线的拟合方式要慎重选择，使它能够真实的反应测量的结果，减少人为因素的引入。目前常用的方式为数学模型法。1、Logit-Log模型Logit-Log转换是使双曲线直线化的最常用方法。它是将标准品浓度转换成Log浓度，作为横坐标，而把B转换成LigitB，LigitB=LogBx/（B0-Bx）。其中B0是0剂量结合率，Bx是任何剂量为X时的结合率（如图）：可以看出，这是一条随剂量增加而下降的直线。这种方法的缺点是：由于剂量取对数，0剂量在拟合时不用，所以灵敏度有损失；如果反应系统不是理想模式，用本方法处理将有较大偏差。2、四参数Logistic模型四参数Logistic模型是国际原子能机构（IAEA）和世界卫生组织（WHO）推荐的数据处理模型，是对Logit-Log模型的发展。其通式为：其中X是抗原剂量，Y是结合%，a、b、c、d为四个参数。对RIA来说，a可取实验所得的最大结合率B0，b可取同一批数据用Logit-Log法作线性回归所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原浓度ED50，d可取实验所得NSB。四参数Logistic模型的图形如图：3、其他拟合模型如四参数单位点作用模型的稳定性较好，个别标准管出现坏点对拟合结果的影响较小；还有二次多项式拟合法、折线拟合法等。应当指出，不论采用何种数学模型进行曲线拟合，实验的结果应该是相同的或相近的，都不能改善实验过程低劣所带来的影响。六、RIA的分析误差和质量控制RIA是一类高灵敏度的超微量分析技术，易受各种因素的影响而使检测结果失真。因此，质量控制体系应包括生产及使用两个重要环节。作为生产厂家，应建立严格的质量检测程序，以保证进入市场的产品都符合质量要求，这是首要环节。作为用户则应建立严格的质量控制体系，以保证检测的质量。根据不同的目的，质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价。（一）误差的来源按误差发生的统计学性质可将其分为：1、系统误差（systematicerror）这种误差常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法误差，如标准品稀释体积不正确；（2）仪器和试剂误差，如仪器状态不佳；量器不准；（3）操作误差，