有助于保护胃粘膜功能评价方法

有助于保护胃粘膜损伤功能试验项目、试验原则及结果判定1试验项目1.1动物实验1.1.1体重1.1.2胃粘膜大体病理损伤状况1.1.3胃粘膜组织病理损伤积分1.2人体试食试验1.2.1临床症状1.2.2体征2试验原则2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。2.256°乙醇、消炎痛致急性胃粘膜损伤模型、冰醋酸致慢性胃粘膜损伤模型、或应激胃粘膜损伤模型根据受试样品声称功能任选一种或多种进行动物实验。2.3动物实验活检前需禁食24小时，禁水8小时。2.4在进行人体试食试验时，应对受试样品的安全性作进一步的观察。2.5停止给予受试物一天后进行效果观察。3结果判定3.1动物实验：（1）模型组与空白对照组相比，大体观察评分与病理组织学检查评分结果有显著性变化；（2）单次高剂量受试组与模型对照组进行比较，单次给予高剂量受试物大体观察评分与病理组织学检查评分结果均无显著变化；（3）连续给予受试物一段时间，大体观察评分与病理组织学检查评分结果均表明胃粘膜损伤明显改善。同时满足（1）、（2）和（3）时，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。3.2人体试食试验：试食前后试食组自身比较及试食后试食组与安慰剂对照组组间比较，单次给予受试物，临床症状、体征积分无显著变化；连续给予受试物一段时间，临床症状、体征积分明显减少，可判定该受试样品有助于保护胃粘膜功能。有助于保护胃粘膜损伤功能评价方法1动物实验1.1原理在一定时间内给予一定量的受试样品，分别用对胃粘膜有损伤作用的物质及应激反应造成急性胃粘膜损伤模型，观察各剂量组胃粘膜的损伤程度；或用对胃粘膜有损伤作用的物质造成慢性胃溃疡模型，在一定时间内给予一定量的受试样品，观察各剂量组胃溃疡的面积和体积，反映受试样品对胃粘膜的保护作用。1.2实验动物选用SD或Wistar健康大鼠，单一性别，180－220克，每组8－12只。1.3实验设计及剂量分组受试物设三个剂量组，其中一个应为人体推荐量的5倍剂量组，并同时设置空白对照组。不同的损伤模型，还应设置相应的模型对照组，一个单次给予高剂量受试物的单次高剂量组。慢性溃疡模型应先造模，手术次日再分组。受试样品给予时间一般为14—30天，必要时可以延长至45天。1.4胃粘膜损伤模型1.4.1急性胃粘膜损伤酒精模型1.4.1.1实验动物：选用Wistar或SD健康大鼠，单一性别。1.4.1.2实验器材及试剂：解剖器械，56°乙醇，病理制片系统，生物显微镜等。1.4.1.3实验方法：动物随机分空白对照组、模型组和受试样品三个剂量组，和一个单次给予高剂量受试样品组。各剂量组灌胃样品30天后，全部动物严格禁食24小时，禁水8小时，此期间亦禁止给予受试物。除空白对照外，所有试验组动物给予56°乙醇1.0ml/只，1小时后处死动物，暴露完整胃，结扎幽门，灌注适量10%甲醛溶液，固定20min，然后沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，根据大体病理学检查的半定量分析方法，按照病变面积在整个胃粘膜所占的比例，诊断半定量为未见异常（0分）、轻微病变（1分）、轻度病变（2分）、中度病变（3分）和重度病变（4分），共分为5个等级。以模型组病变程度重者为重度病变（4分），并以此标准对受试物组每只动物的病变分等级，使模型组、受试物组、单次高剂量组和空白对照组的评分标准一致。其中，单次高剂量组动物首次给予高剂量受试物24小时后，给予56°乙醇1.0ml/只，1小时后处死动物，处理方法同受试组。表1急性酒精损伤肉眼观查评分标准损伤程度1分2分3分4分模型组个体病变面积占整体胃黏膜的比例模型组中轻微病变的个体模型组中轻度病变的个体模型组中中度病变的个体模型组中重度病变的个体病理组织学观察及评分：大体检查完毕，将每只动物胃粘膜损伤最严重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常规制片，HE染色，镜下观察。注意选择胃粘膜正横切面，包括粘膜全层的区域观察。根据病变累及粘膜层的深度为判定粘膜受损严重程度的主要依据，建议将病变分为未见异常（0分）、轻微病变（1分：黏膜受损深度黏膜层1/3）、轻度病变（2分：黏膜层1/3黏膜受损深度2/3）、中度病变（3分：黏膜受损深度2/3）和重度病变（4分：黏膜损伤不仅累及全层，而且黏膜下层可见出血等病变），观察病变类型，作为参考见表2。表2急性胃粘膜损伤镜下评分标准病变1分2分3分4分累及范围＜1/31/3-2/32/3-黏膜全层累及黏膜下层1.4.2急性胃粘膜损伤消炎痛模型1.4.2.1实验动物：选用Wistar或SD健康大鼠，单一性别。1.4.2.2实验器材及试剂：解剖器械，病理制片系统；消炎痛，甲醛等。1.4.2.3实验方法：动物随机分空白对照组、模型组和受试样品三个剂量组，和一个单次给予高剂量受试样品单次高剂量组。灌胃给予动物受试物30天后，禁食24小时、禁水8小时后，模型组和受试组给予消炎痛40mg/kgBW一次性腹腔注射。5小时后处死动物，剖腹将胃取出，结扎幽门和贲门，从十二指肠与幽门部结合处注入10%甲醛溶液5ml，固定20分钟后，沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，用纸吸干，观察胃粘膜损伤程度。病理组织学观察及评分：同急性胃粘膜损伤酒精模型。1.4.3急性胃粘膜损伤水浸应激模型（有待验证）1.4.3.1实验动物：选用Wistar或SD健康大鼠，雄性。1.4.3.2实验器材及试剂：解剖器械，病理制片系统等。1.4.2.3实验方法：动物随机分空白对照组、模型组和受试样品三个剂量组，和一个单次给予高剂量受试样品单次高剂量组。灌胃给予动物受试物30天后，禁食24小时、禁水8小时后，将大鼠束缚于大小适当的特制铁丝笼内(以不能自由活动为度)。随即将动物头部向上垂直浸泡在温度相时恒定（23土0.5℃）的冷水中,水深平大鼠剑突部位，7小时后取出(水温浸泡时间酌情而定)。用颈椎脱位法处死动物,剖腹将胃取出，结扎幽门和贲门，从十二指肠与幽门部结合处注入10%甲醛溶液5ml，固定20分钟后，沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，用纸吸干，观察胃粘膜损伤程度。病理组织学观察及评分：同急性胃粘膜损伤酒精模型。1.4.4慢性胃溃疡模型1.4.3.1动物：选用Wistar或SD健康大鼠，单一性别。1.4.3.2实验器材及试剂：带标尺的解剖镜、微量注射器，醋酸、半胱氨酸等1.4.3.3实验方法：1.4.3.3.1醋酸注射法：将动物禁食24小时，禁水8小时，乙醚或1%巴比妥钠麻醉后实施剖腹手术，消毒腹部，于剑突下切开腹腔，将胃轻拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽门处浆膜下注射20-30l的30%冰醋酸，缝合切口，术后正常喂食和水。第二天将手术后状态良好的动物按体重随机分为模型组和受试样品三个剂量组及一个单次给予受试样品的单次高剂量组。各剂量组按相应剂量灌胃，连续14天。其中单次高剂量组给予单次高剂量受试物24小时候处死，方法同上。模型组灌胃蒸馏水或溶剂。禁食24小时后处死，取出整个胃浸泡于10%的甲醛内，浸泡20分钟后沿胃大弯剪开，洗净内容物，取腺胃区展开平铺于玻璃板上，用纸吸干溃疡内的水分，测量其面积和体积。溃疡面积和体积测量法：于带标尺的解剖显微镜下计数溃疡所占的方格数，换算成面积。然后用微量注射器将有色墨水注入溃疡内，将溃疡填满与周边平齐，读取微量注射器上刻度即为溃疡的体积。1.4.3.3.2冰醋酸浸渍法：将动物禁食不禁水24小时，乙醚或1%巴比妥钠麻醉后实施剖腹手术，消毒腹部，于剑突下切开腹腔，将内径5mm、长10mm的牛津杯垂直放置胃体部浆膜上，向管腔加入冰醋酸0.2ml，1.5分钟后用棉签蘸出冰醋酸，缝合手术切口，术后正常喂食和水，第二天将手术后状态良好的动物按体重随机分组、给药，动物处置和测量等操作同上。1.5数据处理和结果判定数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性。F值≥F0.05，即P≤0.05，用多个实验组和对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计。若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。（1）模型组与空白对照组相比，大体观察评分与病理组织学检查评分结果有显著性变化；（2）单次高剂量受试组与模型对照组进行比较，单次给予高剂量受试物大体观察评分与病理组织学检查评分结果均无显著变化；（3）连续给予受试物一段时间，大体观察评分与病理组织学检查评分结果均表明胃粘膜损伤明显改善。同时满足（1）、（2）和（3）时，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。1.6注意事项动物禁食应完全，应严格控制动物禁食期间食粪便、皮毛、垫料等。2人体试食试验2.1受试者的选择标准2.1.1纳入受试者标准：高风险因素人群见有胃部不适（反酸、嗳气、腹胀、食欲不振等），且3个月内经胃镜检查确诊为轻度浅表性胃粘膜损伤不需要服用药物治疗的自愿受试者。2.1.2排除受试者标准：2.1.2.1年龄在18岁以下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对本样品过敏者。2.1.2.2继发性慢性胃炎。2.1.2.3合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统严重疾病，精神病患者。2.1.2.43个月内用过已知对胃肠功能有损害的药物。2.1.2.5症状、体征分级为重症者。（症状、体征分级见表3）2.1.2.6有严重消化系统溃疡的病人。2.1.2.7正在服用其它治疗药物或接受其它治疗者。2.1.2.8未按规定服用样品，无法判断功效，或资料不全等影响功效或安全性判断者。2.1.2.9胃镜检查确诊为胃间质性纤维瘤或其他器质性病变的患者。2.2试验设计及服样期限采用组间和自身两种对照设计。按受试者的症状轻重随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、病程等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。2.3受试样品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，在试验期间停用其它用于慢性胃病的物品，对照组服用安慰剂。按双盲法（单盲法）进行试食试验。观察时间不少于30天，必要时可延长至45天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。其中试食组首次试食24小时后，进行症状观察及体征观察，即为单次试食结果。2.4观察指标2.4.1安全性指标2.4.1.1一般状况：包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等2.4.1.2血、尿、便常规检查2.4.1.3肝、肾功能检查2.4.1.4心电图2.4.2功效指标2.4.2.1症状观察胃痛、嗳气、反酸、腹胀、食欲不振、少食等临床症状。体征观察剑突下压痛程度。按症状轻重统计积分（重症3分，中度2分，轻度1分），见表3。表3人体试食试验症状轻重分级表症状轻（1分）中（2分）重（3分）胃痛轻微，持续时间短，不影响工作及休息疼痛时间较长，每日超4小时，尚能忍受，但对工作及休息有一定影响疼痛较重，持续难忍，需服药才能减轻嗳气偶有发作经常发作，引及两胁不适频繁发作，引及两胁疼痛反酸偶有吐酸饮食不适即吐酸频繁吐酸腹胀腹胀轻微，时作时止，在短时间内可较甚腹胀较甚或发作频繁，在较长时间内不缓解，影响工作及休息腹胀难忍，持续时间长，需服药才能减轻少食食欲较差，饭量减少1/2以内饭量减少1/2－2/3无食欲，饭量减少2/3以上2.4.2.2体征观察剑突下压痛程度检查，根据疼痛程度分为轻（1分）、中（2分）、重（3分）。轻度：用力时才出现疼痛，压痛轻微1分中度：用力即出现疼痛，但疼痛尚能忍受，压痛明显2分重症：稍微用力即出现疼痛，疼痛不能忍受，压痛剧烈3分2.5数据处理和结果判定统计症状和体征积分值。试验数据为计量资料，可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验。若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验，但变异系数太大（如CV50％）的资料应用秩和检验。结果判定：试食前后试食组自身比较及试食后试食组与