中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(2015年版)中的应用

《中药制剂分析》课程论文中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》（2015年版）中的应用药学（药物分析方向）2012级指导教师：高晓霞2015年11月摘要：中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。如今分子生物学技术在中药材鉴定领域的应用已逐步深入。《中国药典》2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的DNA分子鉴定方法，而《中国药典》2015年版收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，DNA条形码分子鉴定法是利用公认的相对较短的DNA序列来进行物种假定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国家标准的应用层面。关键词：中药材；DNA；鉴定；指导原则一、中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[1]1.1定义及原理该鉴定方法主要适用于中药材（包括药材、药材粉末及部分药材饮片）及基原物种的鉴定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于DNA序列是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4种碱基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。中药材DNA条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。1.2方法与步骤中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。1.2.1供试品处理除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10～100Mg2+备用。1.2.2DNA提取DNA的提取包括破碎细胞壁、释放DNA，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。由于植物类中药材种类繁多，可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进。植物细胞内含有大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。EDTA（乙二胺四乙酸）螯合Mg2+2+或Mn2+，抑制DNase（DNA酶）活性；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，可溶解细胞膜，与DNA形成复合物溶于高盐溶液，降低溶液盐浓度至一定程度，则从溶液中沉淀，经离心即可将CTAB与DNA复合物同蛋白质、多糖类物质分开。三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。β-巯基乙醇是抗氧化剂，在提取DNA过程中加入β-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA提取过程中多酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。因此将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污染。在提取根、根茎、茎木类、皮类的DNA时，一定要注意多糖、多酚的去除；提取叶、花、全草的DNA时要适当增加水浴时间，并可将水浴温度降低；对于果实、种子类以及动物药材类的DNA提取可以参考《中国药典》。1.2.3PCR扩增植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其基原物种扩增COI序列，通用引物及扩增条件如下，具体如有改变见各药材项下。ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI序列扩增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。PCR反应体系以25μL为参照，包括1×PCR缓冲液（不含Mg2+Cl2），2.0mmol·L-1Mg2+Cl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.1mmol·L-1引物对，模板DNA，1.0UTaqDNA聚合酶，加灭菌双蒸水至25μL。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。ITS2序列扩增程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min。psbA-trnH序列扩增程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃7min。COI序列扩增程序：94℃1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，35个循环；72℃5min。1.2.4PCR产物检测采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置出现一条目的条带，阴性对照应无条带。1.2.5测序有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定。使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。1.2.6中药材DNA条形码序列获得主要包括序列拼接和序列质量与方向2个方面的内容。对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列。为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。1.2.7结果判定将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统（http：//）或GenBank数据库中应用BLAST（basiclocalalignmentsearchtool）方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。如果植物类药材ITS2序列比对后最接近的物种为真菌，则需采用psbA-trnH序列重复上述方法流程。中药材DNA条形码鉴定数据库系统及GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程见下。登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站，在主页点击“物种鉴定”。根据需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定（ITS/ITS2）。将需要鉴定的物种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定（ITS/ITS2）”的序列输入栏，点击“提交”按钮，进行BLAST鉴定。在BLAST比对结果中，在“序列比对信息”栏查看相关比对信息，在“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在BasicBLAST中选择nucleotideblast，在EnterQuerySequence中粘贴需要鉴定的序列（Query）（建议用fasta格式）。在ChooseSearchSet中选others（nretc.）数据库，点击左下角BLAST。在BLAST结果中查看序列相似性最高（maxident）的物种，一般为与查询序列最接近的物种。1.3方法学验证1.3.1方法适用性考察采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。1.3.2精密度考察主要分为重复性考察、中间精密度考察及重现性考察。重复性，至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。实验结果判定应基本一致。中间精密度，考察实验室内部条件改变（如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间）对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。重现性，实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形码序列应相同。1.3.3影响因素考察考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取（样品量、水浴温度和水浴时间）、PCR条件（变性时间、退火温度与时间及延伸时间）及产物纯化（考察不同纯化试剂盒），保证实验方法的准确性。1.3.4基原物种对比验证以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DNA条形码数据，与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果准确性。1.4中药材DNA条形码分子鉴定核心序列选择依据1.4.1植物类中药材ITS2和psbA-trnH条形码的选择依据DNA条形码研究的首要任务是确定通用DNA条形码序列。在植物界，研究者主要从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想的DNA条形码，曾提出诸多候选条形码序列或组合。2009年，国际条形码协会植物工作组对来自550个物种907个样品的7个序列（rbcL，matK，rpoC1，ropB，psbA-trnH，psbK-psbI，atpF-atpH）进行了分析比较，建议将rbcL+matK组合作为植物通用条形码[10]。然而，植物工作组认为该组合还远不够完美，寻找植物DNA条形码的工作还没有结束[2]。同年，在墨西哥召开的第三届国际条形码大会上，与会代表一致认为应对ITS/ITS2和psbA-trnH序列进行进一步评估。2010年，陈士林等[3]分析比较了7个候选DNA条形码（psbA-trnH，matK，rbcL，rpoC1，ycf5，ITS2，ITS）。研究对象为药用植物及其密切相关物种。研究结果表明ITS2表现突出，在物种水平的鉴定效率高达92.7%。因此，陈士林等建议将ITS2作为药用植物标准DNA条形码。鉴于研究中psbA-trnH仅次于ITS2序列，也具有较好鉴定能力，因而推荐其作为ITS2的辅助条形码。Yao等[4]基于大样本量分析证实ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码，并以ITS2序列为基础初步建立了药用植物DNA条形码数据库网络查询系统（http：//its2-plantidit.dnsalias.org/）。2011年，中国植物条形码工作组（ChinesePlantBOLGroup）对来自42目75科141属1757物种的6286样本的rbcL，matK，psbA-trnH，ITS序列进行研究，其结果进一步验证了ITS2的鉴定能力，建议ITS/ITS2应成为种子植物的核心条形码，当ITS难以扩增和测序时，ITS2可以有效地弥补该缺陷[5]。陈士林等[6]提出建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系。1.4.2动物类中药材COI和ITS2条形码的选择依据在动物界，Herbert等于2003年首次提出将一段长度约为650bp的COI基因序列作为动物条形码鉴定的基础片段[7]。同年，Herbert等[8]对11门13320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunitI，COI）基因序列进行比较分析，结果表明所研究物种的种间遗传距离在0.0%～53.7%，物种种间遗传距离平均可达到11.3%，79%的物种种间遗传距离均大于8%。以上研究结果进一步支撑了前期的结论。随后，COI基因特定片段的鉴定能力在鸟类、鱼类、节肢动物、哺乳动物等具体动物类群的鉴定研究中均获得了印证，因此研究者一致建议将COI序列作为动物的通用条形码。基于大量前期研究结果，中药材DNA条形码分子鉴定法选用ITS2和psbA-trnH作为植物类药材的核心条形码，COI和ITS2作为动物类中药材的核心条形码。1.5中药材DNA提取方法的确定1.5.1植物