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基因工程技术及其在中药现代化中的应用主讲人姚佳职称讲师中药现代化•一、分子生物学基础知识•二、基因工程原理•三、植物基因工程•四、DNA分子标记在中药鉴别中的应用•五、基因芯片技术与中药研究本章主要内容17:352015/3/41第二章核酸第一章分子生物学基础知识第一节核酸17:352015/3/41第二章核酸：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）核酸：由核苷酸通过磷酸二脂键连接而成的高聚物。核苷酸:是由戊糖的第一位碳上连接一个碱基，第5位碳上连接一个磷酸基团所组成的基本单位，其中碱基和戊糖以糖苷键连接形成核苷第一节核酸17:352015/3/41第二章•RNA中的戊糖为D-核糖，碱基有A、G、T、U•DNA中的戊糖为D-2-脱氧核糖，碱基有A、G、T、C17:352015/3/41第二章第一节核酸基因工程的核心内容是重组DNA。DNA的复制：每个物种通过细胞分裂准确地将遗传信息代代相传DNA变性：某些理化因素的改变，使DNA的双链螺旋结构受到破坏，双链分开，称为DNA变性DNA的性质17:352015/3/41第二章•DNA复性：变性的DNA经过某种处理又重新形成天然DNA的过程，称为复性或退火。重新形成的DNA称为复性DNA。•DNA杂交:复性的DNA分子不是由原来的两条单链形成的，即复性是单链DNA随机结合的过程。当复性的DNA分子是由两条不同源的单链分子形成时称为杂交DNA的性质17:352015/3/41第二章•基因：是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位，•根据是否具有转录及翻译功能分为三类•第一类编码蛋白质的基因•第二类只有转录功能而没有翻译的功能（tRNA和rRNA）•第三类不转录基因第二节基因17:352015/3/41第二章•根据是否具有转录及翻译功能分为三类•第一类编码蛋白质的基因•第二类只有转录功能而没有翻译的功能（tRNA和rRNA）•第三类不转录基因第二节基因17:352015/3/41第二章•基因表达：某些基因进行转录，经过翻译合成各种蛋白质，这一过程称为基因表达。基因表达17:352015/3/41第二章•核酸分子杂交：是应用核酸分子变性复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子的过程。•在分子杂交中，若以识别靶DNA中的特异核苷酸序列为目的，就需要用到探针。第三节核酸分子杂交17:352015/3/41第二章•探针：•是指以研究和诊断为目的，用来检测特定核酸（DNA或RNA）的DNA或RNA片段。•应用前景广阔，用于筛选目的基因、生物分类、基础医学、基因连锁分析等许多领域。第三节核酸分子杂交17:352015/3/41第二章•一、核酸探针的分类•DNA探针•RNA探针•二、核酸探针的标记•放射性标记•非放射性标记17:352015/3/41第二章第三节核酸分子杂交•三、探针与靶核酸杂交•四、杂交信号显示•放射性标记•非放射性标记•（一）材料的预处理•1.洁净•目的：去除外源DNA的污染•2.粉碎•（二）提取方法•1.CTAB法•2.SDS法第四节植物细胞中DNA的提取17:352015/3/41第二章•（三）杂质的去除•1.去除多糖•2.去除酚类•（四）DNA浓度和纯度的检测•1.紫外分光光度法•2.琼脂糖凝胶法•基因工程的诞生·•1972年，美国斯坦福大学的科学家在体外进行了DNA的改造试验，将SV40的DNA及λ噬菌体DNA分别切割，然后再将两个物种的DNA连接起来，首次成功地进行了DNA体外人工重组。•1973年又将重组的DNA分子导入大肠杆菌，第一次成功地进行了无性繁殖，完成了DNA的体外重组和扩增的全过程，基因工程由此诞生第二章基因工程的原理17:351第二章•我国从70年代末开始了基因工程的研究工作。近年来，我国的基因工程取得了卓越的成绩，•利用DNA重组技术表达了乙型肝炎表面抗原、胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶、猪、牛生长素、促红细胞生长素等。第二章基因工程的原理17:353第二章•特别是基因工程乙肝疫苗、基因工程α1型干扰素、促红细胞生长素等都已应用于临床治疗，更有一些基因工程新药正在中试阶段，•但是基因工程技术在生产上经济效益还不大17:352015/3/41第二章第二章基因工程的原理•我国现在还缺乏具有生产意义的基因工程元件（目的基因）。•我国目前还缺乏高效的转录启动子和宿主细胞表达系统，需要努力构建适用于不同宿主系统的高效表达载体系统•基因合成技术的成熟发展，开发基因资源是基因工程发展的基础。第二章17:354第二章基因工程的原理•基因工程下游的重要步骤是表达后产物的分离、纯化、及基因工程产物的后处理工艺。•在表达产物的分泌机制的研究，分泌型载体受体系统的建立等方面，都有待于我们进一步深入研究和开发17:352015/3/41第二章第二章基因工程的原理•基因工程：也称基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。是指某个基因通过载体运送到另一种生物的活细胞内，使该细胞进行无性繁殖（克隆）及进行正常功能（表达），而创造出新的生物品种或新的遗传性状。第一节基因工程的概念17:352015/3/41第二章•具体操作：在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合，形成一个复制子。17:355第二章第一节基因工程的概念•这样形成的杂交分子可以在复制子所在的宿主细胞中复制，通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖成克隆。而后直接利用转化子，或者将克隆的分子从转化子中分离出来后，再导入其他的表达体系，使重组基因在细胞内表达，最终产生特定基因产物17:352015/3/41第二章第一节基因工程的概念•1971年，美国麻省理工学院就有人设想将猴肾病毒SV40的DNA与λ噬菌体DNA重组，然后导入大肠杆菌细胞内，此观点立即遭到许多科学家的反对，他们认为，这种带有病毒DNA的重组体分子有实验室逸出的可能，并且随着大肠杆菌感染到人类的肠道，其后果是不堪设想的第二节基因工程的安全性问题17:356第二章•植物基因工程方面，目前，人们已经可以按意愿培育作物新品种，此举有独特的技术优势和开发效益。但是也有可能对生物品种的多样性、病虫害抗性、环境生态平衡和产品安全性等方面带来潜在的或还没有预测到的不良影响第二节基因工程的安全性问题17:357第二章•在动物基因工程研究方面，科学家们利用高等细胞表达系统生产人用药品，安全性研究显得尤为突出第二节基因工程的安全性问题17:352015/3/48第二章•1限制性内切酶•能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在此处或附近将其切开的DNA核酸内切酶，也称限制酶•2DNA聚合酶•3DNA链接酶第三节各种工具酶17:352015/3/41第二章•目的基因：是指准备重组到受体细胞中进行表达的特定基因片段或DNA片段。•为了得到这段“外源基因”，我们采取分离、纯化、改造、扩增等步骤而获取目的基因•制备方法：物理法、化学合成法、鸟枪无性繁殖法、酶促逆转录合成法第四节制备目的基因的方法17:352015/3/41第二章•包括：密度梯度离心发，单链酶切发，分子杂交法•密度梯度离心法：由于核酸DNA双螺旋中碱基G与C配对，A与T配对，GC对较集中的片段密度较大，采用精密度比较高的密度梯度离心方法可以将被切割成适当大小的DNA片段按密度大小不同分开。在通过与放射性标记的mRNA进行杂交来确定要分离的目的基因片段。•非洲爪蛙rDNA,5sDNA和海胆组蛋白基因就是采用这种方法分离得到的1物理化学法17:352015/3/41第二章•单链酶切法：碱基GC对之间有三个氢键，AT碱基对之间只有两个氢键，所以GC对较稳定。采用加热或变性剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位就先变性成单链，应用单链特异的S1核酸内切酶切除单链，再经过超速离心，分离出没有单链切口的DNA。最早海胆rDNA就是利用这种方法分离到的1物理化学法17:352015/3/41第二章•分子杂交法：单链DNA与其互补的碱基序列在适当的条件下，按“碱基互补配对”原则形成双链，这就是核酸分子杂交的原理。利用核酸分子间可以进行杂交的原理，非同源的DNA可以互补配对，DNA与RNA之间也可以配对，采用这种方法既能分离也能鉴定目的基因。果蝇18S、28SrDNA就是采用分子杂交的方法分离得到的1物理化学法17:352015/3/41第二章•主要包括•磷酸二酯法•磷酸三酯法•固相磷酸三酯法2化学合成法17:352015/3/41第二章•鸟枪法：一种基于基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法（机械剪切、超声波等）或酶切方法将生物细胞染色体的全部DNA切割成基因水平大小的片段，将这些片段与适当的载体结合成重组体，导入宿主细胞，构建成基因文库，之后再结合筛选方法，从众多转化细胞中选出含有目的基因的转化子，提取、分离、回收重组的DNA。3鸟枪无性繁殖法17:352015/3/41第二章•主要用于分子量较大而又不知道序列的基因•它以目的基因的mRNA为模板，由逆转录酶催化合成互补的cDNA。再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，与载体结合后转入受体菌，扩增为cDNA文库，再从文库中筛选出目的基因4酶促逆转录合成法17:352015/3/41第二章•PCR也称无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法.5聚合酶链式反应(PCR)17:352015/3/41第二章•具体操作：在适当的缓冲体系中加入模板双链DNA（目的基因片段）、热稳定的DNA聚合酶、引物及四种dNTP按照模板的互补规则，从引物的5’到3’方向延伸，合成新的DNA链，使模板单链DNA重新复制成双链。新的双链DNA数量上应该是开始加入的模板DNA的两倍，然后再开始第二次循环扩增，这样双链DNA的数量就以2的n次方是数量级增长5聚合酶链式反应(PCR)17:352015/3/41第二章•克隆即是获得目的基因的重组体DNA的无性繁殖系，基因重组是目前基因克隆操作的核心内容。基因重组就是在获得目的基因后，再将其与经过工具酶切割或修饰的载体DNA连接，目的基因随着可自我复制的载体DNA一起转入受体细胞，使外源目的基因可在受体细胞内正确表达。所以，首先要选择适当的载体对其进行修饰第五节基因载体的选择与构建17:352015/3/41第二章•载体基因的特性：•1.在其中插入了目的基因的载体DNA能在受体细胞中独立和稳定地自我复制，且本身遗传特性不变•2.易于从宿主细胞中分离和纯化出来•3.在载体复制的非必需区，有限制酶切位点，最好是单一位点•4.具有可检测的表型特征第五节基因载体的选择与构建17:352015/3/41第二章•细菌质粒是细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，他在细菌细胞内可以自主复制，并可遗传给子代，但不是细胞生存必须的•质粒DNA分子呈共价双链闭合环状，自然旋转成螺旋构像，有时单链断开成为开链环状双链断开成线型DNA1细菌质粒载体17:352015/3/41第二章•根据质粒复制与宿主菌的相关程度，将其分为严密型和松弛型两种•质粒的抗药基因在基因工程中应用价值较高1细菌质粒载体17:352015/3/41第二章•细菌质粒载体携带外源基因只限于10kb以下的DNA片段，噬菌体作为载体可插入10kb-20kb或更大的DNA片段。•λ噬菌体是一种温和的噬菌体，在感染大肠杆菌时，呈现溶菌性和溶源性两种生长方式2噬菌体载体17:352015/3/41第二章•2.单链噬菌体载体•是一种含有单链环状DNA基因组的大肠杆菌特异噬菌体，基因长度6-7kb•3.粘性质粒载体：是含有抗性基因、单一克隆位点以及λDNAcos位点的细菌质粒。2噬菌体载体17:352015/3/41第二章3动物病毒载体17:352015/3/41第二章•酵母质粒载体既可以在大肠杆菌中、又可以在酵母系统中进行自我复制与扩增。•1.整合载体它带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因•2.自我复制载