临床免疫和免疫检验实验指导

临床免疫和免疫检验实验指导23（一）免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。（一）抗原制备和动物的选择1．抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。2．动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。（二）抗原的注射途径和剂量1．注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。近期发展在局部淋巴结或足等部位注射抗原。不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。2．抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。3．每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为2~4天。加佐剂抗原为10~15天。（三）佐剂的作用原理及种类：1．原理：佐剂又称免疫增强剂。它可以增强抗原的免疫原性及改变机体的免疫反应性，达到增强免疫力或提高抗体产生水平及在体内维持时间明显延长。2．种类：通常多用福氏佐剂（Freundadjuvant），它分为福氏不完全佐剂（IncompleteFreundadjuvant）和福氏完全佐剂（CompleteFreundadjuvant）。福氏不完全佐剂既抗原水溶液（1~5mg/ml）1ml、油剂（液体石蜡）4ml、乳化剂（羊毛脂）1g混合而成4油和水的乳悬液。福氏完全佐剂在上述成份中按10mg/ml加入卡介苗。3．配制方法：先将羊毛脂与液体石蜡混合分装小瓶，高压蒸汽灭菌，8磅20分钟，保存4℃冰箱，使用前再溶化，制备可分研磨法和注射法。前者将乳悬液在微火上溶化后，按比例加入卡介苗，边滴边研磨，使菌体完全分散，按同法加抗原，每加1滴应研磨数转直至小滴消失，加抗原要慢，待抗原全部滴入后则成乳白色粘稠的油包水乳剂。后者将等量的乳悬液和抗原卡介苗混合液分别吸入两个附有针头的5毫升注射器内。将其之一与约长6厘米的塑料管连接，针头穿入约1厘米，然后稍稍推动针管，使液体进入塑料管直至距塑料管开口端还有1厘米距离为止，同时由另一人将另一个5毫升注射器与塑料管开口端相连，此时二人相对而坐，左手固定针头与注射器的连接处，右手交替推动针管，反复操作，直至形成粘稠的乳剂为止。制成的乳剂是否油包水乳剂，直接影响到免疫的效果，因此每次制成后要进行检查。方法是将佐剂抗原滴入冷水表面，滴入后应保持完整而不分散，若滴入后分散，说明不合格，要另行配制。（四）免疫的方法：1．无佐剂免疫法：应根据抗原的性质采用合理方法。颗粒性抗原（红细胞、细菌）通常不需采用加佐剂方法。将某种抗原（浓度约1%）根据下列的顺序、每次间隔3~5天免疫动物（兔）皮下注入抗原0.3ml肌肉0.4ml足0.4ml静脉（耳）0.4ml皮内0.5ml于最后一次注射后7天，采耳血，分离血清，用特异抗原测定其效价。2．福氏佐剂免疫法：1）一般免疫方法：第一针剂量为每只家兔注射1毫升加佐剂的抗原。注射途径为两只后足掌，每只0.2毫升，其他各淋巴结附近部位，多点皮内注射。总量为0.6毫升。第二针间隔在第一针免疫后3~4周。剂量为不加佐剂的抗原1毫升。注射途径为背部多点皮下注射。第三针间隔时间为第二针免疫后1~2周，剂量和途径同第二针。2）淋巴结免疫法，卡介苗致敏：每只兔后足各注射活卡介苗（75mg/ml）0.3ml，10~14天后两侧窝淋巴结可肿大，如蚕豆大小，既可作淋巴结注射。第一针于两侧窝淋巴结内注射佐剂抗原（1mg/ml），每个淋巴结内注射0.25ml。注射加强针，两次间隔时间、注射次数、剂量、途径与一般免疫方法相同。（五）采血1．试血：一般在最后一次注射后的7~10天，既可由耳缘静脉取少量血，分离血清进行试血。多采用环状试验，在10分钟内能出现“++”沉淀环为合格。目前更多采用双向扩散法，经37℃24小时后观察结果，效价在1:16以上既可用。2．放血：当免疫血清效价达到所需要滴度时，由心脏或颈动脉用无菌手续采血。（六）分离血清：5将收集血置无菌试管或三角瓶内，凝固后，用无菌滴管沿试管边缘将血块与瓶壁脱离，先放37℃，2小时后，再放4℃过夜，使血清充分析出，经离心2000rpm，20分钟，分离出血清，待鉴定合格后方可使用。实验二、免疫血清的鉴定、纯化和保存一、免疫球蛋白的提取与鉴定：各类免疫球蛋白及其与其它血清蛋白间，根据它们的分子大小、电离密度、等电点以及在水溶液中的溶解度不同等，得以相互鉴别与分类。利用上述特性，还可以从液体中分离和提取各种免疫球蛋白。（一）免疫球蛋白的分离提取：1．盐析法（Saltfractionation）：蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同。血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。其方法步骤如下：（1）配制饱和硫酸铵溶液：取500ml蒸馏水加热至70~80℃，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20分钟，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调pH为7.0。（2）用50%饱和硫酸铵提取血清中β、γ球蛋白：血清一份加生理盐水一份混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵二份中，边加边搅拌，防止形成团块降低沉淀物的特异性。混匀后静置30分钟或置4℃冰箱过夜。（3）高速低温离心10000rpm，10分钟，将上清液（含白蛋白）弃去，取沉淀物（含球蛋白）溶于少量生理盐水中。（4）用33%饱和硫酸铵提取γ球蛋白，方法是将上述提取物生理盐水溶液两份加一份饱和硫酸铵。然后再离心10000rpm，其余操作同上。（5）按同样方法用33%饱和硫酸铵再提取一次。（6）将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。2．凝胶过滤法（Gelfiltration）：利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质，可分离提纯分子量不同的大分子物质。在凝胶过滤过程中，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先流出凝胶柱外，分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢而最后流出柱外，这样就能将分子量不同的物质分离。（1）材料：样品（正常人血清），SephadexG-200，2.5×100mm层析柱，洗脱液（PBS或含NaCl的Tris―HCl缓冲液）。（2）方法：6①处理凝胶：将SephadexG―200用蒸馏水经充分膨胀后进行浮选。②装柱：在层析柱底部铺加一层尼龙纱，然后将洗脱液饱和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内。③加样：在凝胶柱表面再加一层尼龙纱，沿管壁缓缓加入样品，所加样品的体积不超过凝胶柱的10%。④洗脱：洗脱液洗脱，流速20ml/小时。待样品洗脱下来（用20%磺酸水杨素检测）既用试管分段收集。⑤蛋白测定：在紫外分光光度计上测定各管样品的O.D280nm，以判读各管蛋白含量。附：样品洗脱完毕后，凝胶即已再生。一次装柱可反复使用多次。凝胶悬液加防腐剂后于冰箱内可保存数月。（3）结果分析：正常人血清经凝胶过滤后可分出三个主要蛋白峰。IgM是在第一峰中，和IgM分子量接近的α2―巨球蛋白也在第一峰。第二峰主要是IgG，在第二峰开始部分含IgA和IgD，第三峰为蛋白和分子量100，000以下的球蛋白。3．离子交换层析法（Ionexchangechromatography）：以离子交换剂为介质，吸附带相反电荷的高分子物质，由于高分子物质的电荷量，等电点不同，用不同离子强度或pH值的洗脱液能置换不同的高分子物质。据此可分离提纯免疫球蛋白，是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一。（1）材料：样品（经pH8.0，0.015MPB透析过的正常人血清，或经饱和硫酸铵提取的免疫球蛋白），DEAE―纤维素（阴离子交换剂），2.5×25cm层析柱，及洗脱剂（不同离子强度的PB）。（2）方法：①离子交换剂的预处理：取适量DEAE―纤维粉剂，用0.5NNaOH除去色素和细粒，用蒸馏水洗成中性后，再用0.5N的HCl洗涤，最后用蒸馏水洗成中性并用缓冲液平衡。②装柱：与凝胶过滤相同。③加样：在层析柱顶部留有少量缓冲液时，既开始加样。在样品渗入柱内液面约留有0.5ml时，以数毫升缓冲液冲洗柱壁。然后滴加洗脱剂并调整流速为1~2ml/分，进行洗脱。④洗脱：根据提取免疫球蛋白种类的不同而选择不同pH及克分子量（molarsolution“M”）。例如提取血清IgG用0.01MpH7.4洗脱，而血清IgA则为1MpH6.4为洗脱液。⑤蛋白测定：同凝胶过滤法。（二）免疫球蛋白的鉴定：1．血清学方法鉴定：经提纯的免疫球蛋白可做为抗原，用已知的抗血清进行鉴定，方法可选用琼脂单向扩散法、双向扩散法及免疫电泳等方法。2．聚丙稀酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）：聚丙稀酰胺凝胶电泳是利用丙稀酰胺（Acrylamide,Acr.）与双丙稀酰胺（N,N―methyleneBisacrylamide,Bis）在催化剂作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳，因此它兼有分子筛效应与电泳效应。各种蛋白质分子通过凝胶孔时所受阻力程度与其大小、形状有密切关系，因此可分开泳动率很相近而分子大小形状不同的蛋白质。可用于鉴定和分离高分子物质。7（1）材料：样品（提纯的免疫球蛋白），丙稀酰胺，加速剂（TEMED或DMPN），催化剂（过硫酸铵），Tris（三羟基氨基甲烷），HCl，甘氨酸，20%蔗糖，0.5%溴酚兰，0.05%氨基黑染液，5%醋酸，园盘电泳仪。（2）方法：①配制聚丙稀酰胺凝胶：贮存配制：A液（pH8.9Tris―HCl缓冲液）：48ml1N的HCl加36.6gTris，再加蒸馏水至100ml。B液：28g丙稀酰胺加0.735g双丙稀酰胺，再加蒸馏水至100ml。工作液配制：甲液：1份A液，2份B液，1份蒸馏水混匀。乙液：0.4g过硫酸铵加蒸馏水100ml。临用前以甲液1份+乙液1份+DMPN或TEMED（配8ml工作液时加2滴）。②配制电极缓冲液（pH8.3的Tris―甘氨酸缓冲液）：Tris6.0g加甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1，000ml。临用时将此液再稀释10倍。③聚胶：在电泳园盘上装入凝胶管，下口用玻璃珠堵塞，加入配制好的凝胶工作液。凝胶面上加0.5mm水层，凝聚后再吸去水层并取下玻璃珠。④加样：加入血清或提纯的免疫球蛋白约10μl，样品上加1滴20%蔗糖（防止样品与电极缓冲液对流）。为便于示踪，样品内可加0.5%溴酚兰5μ做指示剂。最后在样品管和电泳槽中加满电极缓冲液。⑤电泳：每管3mA，电压220V，泳动3小时。⑥染色：从管中取出凝胶，浸于0.05%氨基黑染色液中染色约半小时，再放入5%醋酸中脱色至无余色脱下为止（约需1天）。（3）结果分析：可以通过标准品进行定位。（三）保存：经鉴定合格后，将免疫血清中加1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%，或0.05%，然后将免疫血清分装