乙型肝炎病毒基因组序列分析【摘要】目的分析四川省木里县1株乙型肝炎病毒基因组特征。方法从HBsAg阳性的血清标本11B18中提取病毒DNA,经多聚酶链反应和核苷酸片段测序后,用Mega4软件和Simplot软件做进化树分析和重组分析。结果S基因和C基因核苷酸序列进化树分析显示11B18分别属于D基因型和C基因型,全基因组核苷酸序列进化树分析显示此株与C1基因亚型参考株在同一进化分枝上;重组分析证实此株为C/D基因型重组株,与D基因型的重组位点大约在nt140~nt740。结论与我国西部地区的CD1和CD2两种C/D基因型重组株比较,11B18属于C1基因亚型,其与D基因型的重组位点也有差异。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科,其基因组全长约3.2kb,含有4个相互重叠的开放读码框(P基因,PreC/C基因,PreS/S基因和X基因)。根据基因组或S基因核苷酸序列差异,HVB可分为A~H8个基因型[1~3];各基因型呈一定的地理区域分布,并与一定的血清亚型相关[4]。我国HBV以B和C基因型为主,西部地区存在D基因型及C/D重组基因型[5~8]。为了解四川省HBV的基因型,对收集到的部分HBsAg阳性血清标本进行了核苷酸序列分析,在四川省木里县1份血清标本中检测到1株C/D基因型重组HBV,其重组位点与我国西部地区的CD1和CD2基因型重组株不同。1.材料与方法1.1血清来源血清标本编号为11B18,采自木里县1名6岁彝族儿童,血清学检测其HBsAg和HBeAg均阳性。1.2HBVDNA提取使用Maxwell16DNApurificationKit(Promega)按厂家说明书提取病毒DNA。1.3多聚酶链反应(PCR)和核苷酸测序PCR在PTC-200(MJ)上进行,试剂为PCRMasterMix(Promega),所用引物见表1。PCR条件为:94℃预热3min,然后94℃30sec,55℃30sec,72℃1.5min,共40次循环,最后72℃10min延伸。PCR产物用WizardSVGelandPCRCleanupSystem(Promega)按厂家说明书进行纯化。纯化PCR产物用相同引物分别进行双向标记,标记试剂为BigdyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems),反应条件为:96℃10sec,50℃5sec,60℃4min,共25次循环。标记产物用BigDyeXTerminatorPurificationKit(AppliedBiosystems)再次纯化后,在3500xLGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)上完成测序。1.4基因型分析和重组分析11B18核苷酸序列与HBVA~H基因型/基因亚型参考株序列(包括我国西部地区的CD1和CD22种C/D基因型重组株)比对后,用MEGA4软件做进化树分析(Kimura2参数模型,配对删除,邻位-连接法,500次bootstrap检验)[9],根据进化分枝聚集确定基因型。使用SimPlot软件进行重组分析。11B18标本HBV基因组序列已在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中登记(AB674504)。2.结果2.1核苷酸序列分析11B18基因组全长为3215bp,4个开放读码框的位置与C基因型参考株位置一致,在PreS基因上未发现缺失,且与除C基因型参考株外的其它基因型核苷酸序列差异都8%。与各C基因亚型参考株比较,11B18与C1基因亚型参考株的核苷酸差异最小(3.3%±0.5%)。根据S基因序列推导其表面抗原122位、160位和127位氨基酸分别为精氨酸、脯氨酸和赖氨酸,确定11B18的血清亚型为ayw2。2.2进化树分析S基因进化树分析显示11B18与CD1、CD2重组株和其它D基因型参考株聚集在一起,属于D基因型,但PreC/C基因、X基因和P基因进化树分析均显示11B18均与C基因型参考株(包括CD1和CD2)聚集一起(数据未显示)。全基因组进化树分析也证实11B18C与C1基因亚型参考株在同一进化分枝上(bootstrap值为98%)(图1)。注:木里县11B18分离株以“▲”标示,各参考株以基因型/基因亚型(包括CD1和CD2重组株)、GenBank登录号和来源地标示。≥70%的Bootstrap值显示在分支上。2.3重组分析与非重组的A~H基因型参考株重组分析显示,CD1重组株(CHN-L53标本,GenBank登录号AY817512)与D基因型参考株序列的重组位点大约在nt10~nt740(图2A);CD2重组株(Tibet127标本,GenBank登录号AY817515)的重组位点大约在nt10~nt1450(图2B);11B18与D基因型参考株序列的重组位点大约在nt140~nt740(图2C)。3.讨论一个区域内如果有不同基因型的HBV同时流行循环,则容易发生重组[12,13]。除日本外其他亚洲国家的B基因型HBV,其PreC/C基因片段与C基因型HBV发生了重组[14,15]。我国的HBV以B和C基因型为主,在西部地区存在D基因型以及CD1和CD22种C/D重组基因型[6~8]。S基因基因进化树分析显示118B18属于D基因型,其血清亚型也为D基因型中常见的ayw2血清亚型,但PreS、PreC/C基因、X基因和P基因进化树分析均显示11B18属于C基因型(数据未显示)。Wang等将我国的C基因型HBV分为C1、C2、CD1和CD2四种基因亚型[16],在进化树上CD1和CD2与C1~C6基因亚型分离形成独立的进化分支。11B18虽然也是C/D基因型重组株,但不属于CD1或CD2基因亚型,而是与C1基因亚型聚集在同一进化分支上(图1),其与D基因型重组位点大约在nt140~nt740,也与CD1和CD2的重组位点不同(图2A、图2B、图2C)。木里县是一个藏、彝、汉、蒙古等多民族共同居住的藏族自治县,HBV遗传背景相对复杂。11B18标本采自偏远乡村1名6岁彝族儿童,在采集到的同村和邻村其他学龄前彝族儿童血清标本中,也检测到C1、B2基因亚型HBV和暂定的I基因型HBV[17],提示该乡有多种基因型(或基因亚型)的HBV循环存在。该乡及周围地区是否还能发现其它C/D基因型重组株,是否11B18能代表一种不同于CD1和CD2的其它C/D基因型重组类型,还需更多的监测数据加以阐明。