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乙酰化修饰定量蛋白质组学主要内容乙酰化修饰非标定量技术简介乙酰化修饰非标定量技术原理乙酰化修饰非标定量技术优势乙酰化修饰实验流程乙酰化修饰实验结果示例乙酰化修饰实验详细步骤经典案例乙酰化修饰非标定量技术简介蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下，蛋白质的赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一种机制。最近的调查表明，蛋白质的赖氨酸残基的乙酰化普遍存在于人体的代谢酶之中，具有调节代谢通路及代谢酶的活性。乙酰化是一个普遍和重要的蛋白质翻译后修饰，主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面，还影响参与细胞周期和新陈代谢、肌动蛋白聚合控制，蛋白的乙酰化状态调节受损的癌症和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性，与肿瘤等等疾病密切相关，也是目前正在开发的抗癌药物的靶点。通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现，在生理状况下，存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰，具有广泛的生物学意义。乙酰化修饰非标定量技术原理技术原理赖氨酸发生乙酰化的蛋白对各种生物功能进行调控。实验基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体，对含有乙酰化修饰的赖氨酸肽段进行富集。乙酰化之后的肽段，质量发生42Da的质量变化，基于非标定量的质谱方法对乙酰化肽段进行鉴定。如：组蛋白乙酰化多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基，将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰基转移酶(histoneacetyltmnsferse，HATs)和组蛋白去乙酰基转移酶(histonedeacetylase，HDACs)共同决定。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，精确地调控基因的转录和表达。乙酰化修饰非标定量技术优势乙酰化抗体：特异性识别乙酰化赖氨酸残基；精准锁定目标范围。灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；适用范围广：可以对任何类型的蛋白质乙酰化进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：不受样本数据限制，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；自动化程度高：液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。乙酰化修饰实验流程乙酰化修饰实验流程。1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质；2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切；3：各组样本肽段进行纯化；4：各组样本的肽段分别用乙酰化抗体试剂进行富集，并RP分离馏分；5：Q-Exactive质谱检测，定性及定量分析；6：流程化生物信息分析及个性化设计生物信息服务蛋白质样品制备样品及实验预判酶解乙酰化抗体富集RP分解质谱分析软件分析定性定量蛋白质组学结果统计学、生物信息分析乙酰化修饰实验结果示例小鼠的肌肉样本：乙酰化修饰实验（4例样本：A、B、C、D）1:提取各组蛋白质，定量并用胰酶酶切；2.各组肽段纯化，并用乙酰化修饰抗体进行富集；3.RP分离和质谱分析.4:不同样本中乙酰化修饰的差异表达可通过二级质谱中峰面积确定5.根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性及定量信息。质谱扫描完毕，得到质谱信号总图横坐标是洗脱时间，纵坐标是信号强度。乙酰化修饰实验结果示例4例样本共鉴定到1449个蛋白，肽段6879个，乙酰化修饰肽段637个。乙酰化修饰的差异分析如下：两两比较显著差异B/A189C/B202D/C248C/A243D/A273鉴定到的蛋白列表-结果鉴定到的肽段列表-结果乙酰化修饰实验结果示例生物信息数据交盖图原始数据表达量图表达量分布图箱线图GO富集分析Pathway通路富集分析高阶（客制化）信息分析详见信息分析PDF乙酰化非标定量详细实验步骤1：蛋白质提取提供专业的样本制备，与后期翻译后修饰富集、液相、质谱完美对接。注意事项：1、样本不要反复冻融。收集后立即放于液氮中或-80°冰箱保存。2、原始样本湿重大于1g，根据不同样本得率情况尽量多提供原始样本。3、提得的蛋白大于5mg，可完成一次正常富集。若样本珍贵难获取，最少2mg可完成一次实验。乙酰化非标定量详细实验步骤2：蛋白质定量(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步(2)定量取各组样本的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，考染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。乙酰化非标定量详细实验步骤3：酶切，富集(1)每组样本（各5mg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h(2)12000rpm离心15分钟，弃上清，用lysisbuffer充分混悬溶解样品；(3)加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1h；(4)加入半胱氨酸封闭试剂1μL,室温处理10分钟；(5)按照酶：蛋白质=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）；(6)收集肽段，纯化，真空冷冻干燥。(7)乙酰化抗体富集(8)RP分离(9)质谱检测乙酰化非标定量详细实验步骤4：除盐，此步操作是将实验过程和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。（1）100%乙腈冲洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上（4）0.1%TFA冲洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脱下样品（6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。乙酰化非标定量详细实验步骤5:RP液相分离或手动RP（1）仪器及试剂：涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）离心机（Thermo，型号：PICO17）RIGOLL-3000高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司）色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，100Å（Agela，货号：DC952505-0）乙腈（Merck，货号：100030，德国）氨水（Sigma-Aldrich，货号：17837，美国）流动相A：98%ddH2O，2%乙腈（pH10）流动相B：98%乙腈，2%ddH2O（pH10）ddH2O用氨水调pH值到10（2）样品用100ul流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用。（3）使用酶解好的BSA标准品进行分离测试（柱温45℃，检测波长214nm），检测系统情况。取100ul准备好的样本上样。流速0.7ml/min，分离梯度如右图所示：（4）根据峰型和时间共收取梯度,根据规则合并，真空离心浓缩后，待质谱分析。质谱鉴定：MS扫描范围400-1800MS/MS扫描范围100-2000时间（分钟）流动相B比例（%）05583518623264956895725乙酰化修饰详细实验步骤6:纳升级反相色谱-QExactive进行蛋白质分析（1）仪器及试剂：涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）离心机（Thermo，型号：PICO17）高效液相色谱仪：（ThermoScienticEASY-nLC1000System（NanoHPLC））质谱系统（Thermo，型号：Q-Exactive）流动相A：100%超纯水，0.1%甲酸流动相B：100%乙腈，0.1%甲酸甲酸：（Sigma-Aldrich，货号：56302，美国）甲醇：（Sigma-Aldrich，货号：14262，美国）预柱（AcclaimPepMap100column，2cmx100μm，C18，5μm）色谱柱（EASY-Spraycolumn，12cmx75μm，C18，3μm）进样瓶（Thermo，11190533）瓶盖（Thermo，11150635）喷针（Thermo，PN：ES542）（2）具体操作参数时间（分钟）流动相B比例（%）045154025653570958295854904将高pH反相分离得到的组份用20μl2%甲醇，0.1%甲酸复溶。12,000转离心10分钟，吸取上清上样。上样体积10μl，采取夹心法上样。LoadingPump流速350nl/min，15分钟。分离流速350nl/min，分离梯度如下：乙酰化非标定量详细实验步骤7:数据检索乙酰化非标定量的质谱分析是由ThermoQ-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理。检索参数设置如下：参数名称实验选项FixedmodificationCarbamidomethyl(C)VariablemodificationOxidation（M），Acetyl（K），Acetyl（N-term）peptidetol.15ppmMS/MStol20mmuMaxmissedcleavages2InstrumentQ_ExactiveEnzymeTrypsinDatabaseuniport_乙酰化修饰经典案例案例：实验设计：3组样本（每组各3例）：正常肝脏、肝炎、肝癌。研究目的炎症、癌症发展相关的信号传导、以及癌症机理。希望通过蛋白质功能阐释生物学意义。肽段11255个，乙酰化肽段1325个，鉴定到蛋白1562个，肝炎/肝癌的显著差异中上调357个,下调218个，有和无差异159个。富集到与细胞染色体结构、细胞周期和新陈代谢、核内转录调控因子激活方面。结论：人类肝脏研究的蛋白质组学数据揭示了几个药物靶向，发阐释肝病的代谢通路相关研究。26相关杂志对重复性要求MCP需要描述数据的生物学可靠性是如何通过生物学重复、统计方法、独立实验等确定的。只基于一次生物实验结果的数据是不能接受的（除验证生物学信息系统的数据集以外）。假如基于同一样本来源的生物学重复无法实现，（如病人样本），合理大量的相似生物学样本进行试验是必要的。JP必须提供实验设计，其中包括生物学与重复次数，只有一次生物学/分析重复是不能被接受的。在临床研究中，利用适当的样本数为数据做统计分析是十分可行的。Proteomics必须提供实验的设计，和生物学重复的次数，一次生物学重复不能被接受JPR没有明确提出需要做生物学重复和技术重复，但是要求能对生物学可信性和技术可信性进行说明。Cell和nature这两个杂志，没有找到对重复性的硬性要求，但是cell对实验的设计要求给出重复次数27建议首选2-3次生物重复，最好3次或以上•生物学重复样品较多时，可以适当混合以减少样品数目•组内样品个体差异大的材料需要更多的生物重复•无任何重复，可以结合其他技术进行验证差异倍数：•通过生物重复或技术重复确定倍数•无重复，用经验值，一般在1.2、1.5或2倍•显著性检验p-value：满足p＜0.05或p＜0.01，P＜0.05更常用•一般是两者同时使用THANKS!