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课题3血红蛋白的提取和分离【课题目标】本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。【课题重点与难点】课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【导学诱思】思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？思考3：高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、概念：根据被分离蛋白质的，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3、具体过程：A.的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B.（1）混合物上柱；（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。（4）不同的蛋白质分子完全分开；（5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，的蛋白质还在行凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板进中。㈡缓冲溶液：1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2、作用：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH基本不变。3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲对？思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）㈢电泳：1、概念：指发生迁移的过程。2、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有在下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3、分类：①电泳②电泳。测定（蛋白质相对分子质量）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于。二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除②方法：离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤⑤低速离心（低速短时间）⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。(2)血红蛋白的释放加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.阴极阳极加入待分离的样品带电性质、分子大小和形状的不同，使分子迁移速度不同分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层）：甲苯层第2层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体第3层（中下层）：的水溶液层，的液体第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层(4)透析2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集的收集器内③顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择：。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。（3）凝胶色谱柱的装填方法①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分12小时。3）样品加入与洗脱（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口（2）加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用将1ml的样品加到色谱柱的③样品渗入凝胶床：④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤收集：待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集一试管连续收集思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备3）样品处理：4）把凝胶固定于电泳装置上5)加样：按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品6)电泳7）剥胶8）染色9)脱色10)观察结果SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。三实验结果分析与评价观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。课堂练习1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快2.蛋白质提取和分离分为哪几步()A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定3.在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C．防止血红蛋白被02氧化D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能4．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明()A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动5.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面