搜索
一、什么是蛋白质组学定量及分析方法的主要原理。蛋白质组学定量分析主要包括两种方法：1、建立在2－DE基础上的电泳方法：其原理是通过比较通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。提供蛋白质表达水平的信息。2、利用质谱检测技术：对来自不同样品的肽段标上一个内部标准，使得可以识别不同样品来源的肽段，以质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据二、请列举预测蛋白质相互作用的方法1、酵母双杂交法：主要原理是将可能存在相互作用的蛋白之一与Gal4的DB结构域融合。另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。如果在两个待测蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。2、免疫共沉淀法：免疫共沉淀是一种比较经典的蛋白质相互作用方法，其实验比较简单。裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性亲和再分析结合复合体。目前常使用Pull－down实验结合免疫共沉淀可以对可能的蛋白质相互作用进行验证。3、高通量质谱蛋白质鉴定：使用一分子标签如FLAG标记把蛋白，使融合蛋白在细胞内过表达。通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中把蛋白形成的蛋白质复合物。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。此法适合于分析天然状态下细胞内浓度较低的蛋白质，但是如果蛋白质浓度过高则背景较强，产生假阳性。4、串联亲和纯化（tandemaffinitypurification,TAP）：该技术核心是设计一个双重分子标签，包括A蛋白（IgGbindingprotein）、TEV蛋白酶切位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近把蛋白的天然状态。可以与把蛋白相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温浴在一起，通过A蛋白复合物结合在IgG上。冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱复合物。在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被钙调素的温育在一起，复合物就结合在珠子上。进一步洗去杂质后，加入EGTA鳌合，复合物脱落。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶切割后进行质谱分析。该方法检测到的蛋白质相互作用更加接近自然条件下蛋白质的性质，包括浓度，定位和翻译后修饰。适合于检测大量蛋白质之间的相互作用而形成的复合物，而不局限在两个蛋白质之间相互作用。但是不能检测蛋白质复合物形成的顺序。需要与酵母双杂交等方法互补。三.试述如何应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学的研究，并分析其优缺点。2D-PAGE原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离出来。应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学研究主要步骤有：1、在应用2D-PAGE研究差异蛋白质组学问题时首先要获得要进行差异比较的组织，如肿瘤组织与癌旁正常组织，然后裂解组织和细胞，抑制蛋白酶活性，出去非蛋白质的DNA，RNA，脂类等物质，溶解蛋白质，溶解并抽提总蛋白质。2、将准备好的蛋白质进行2D-PAGE实验，先选择合适的PH范围进行等电聚焦，平衡胶条，再进行第二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、对2D凝胶进行染色处理（可选择各种染色方法），利用软件分析比较成对组织的2D结果，找到上调或下调的蛋白质点。4、将有差异的蛋白质点切割下来进行质谱分析，质谱谱图通过查询数据库找得蛋白质点对应的蛋白质。5、对于得到的有差异的蛋白质要进一步进行验证，常用的手段包括：WesternBlot,RT-PCR,免疫组织化学等。利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的优点主要在于：1、效率高：目前，一块胶板(16cm×20cm)可检测到3000～4000个甚至10000个蛋白斑点。2、可重复性好,80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围(0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；3、灵敏度高：SDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离10～100kD分子量的蛋白质；银染色法可检测到4ng蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定20ppm的标记蛋白。利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：1、对盐，DNA等杂质高度敏感。2、对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。3、对PH和MW的范围有所限制。4、耗时，无法自动化。四、蛋白质组学主要研究内容及当前主要研究任务。五、论述蛋白质组学与基因组学的区别和联系。基因组蛋白质组1同一性：同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；多样性：对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的；2有限性：基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，；对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。无限性：由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。3静态：一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；动态：个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的；4周期性：基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；空间性：不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用5孤立行为：基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰；相互作用：蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用。6单一手段：在基因组研究中，DNA测序技术是最基本和最主要的工具，因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务；多种技术：在蛋白质组研究中，需要的研究技术远远不止一种，并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术；蛋白质组研究技术可以简单地分为两大类：蛋白质组分离技术，蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。7在后基因组时代，蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，蛋白质组的许多工作也离不开对基因组的研究。六、什么是蛋白质组及蛋白质组学？Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能.七、蛋白质研究的基本技术与研究路线。蛋白质组研究的宗旨－－将组织或细胞所有蛋白质（至少是大部分）分离与鉴定。只要技术有：1.双向电泳（2－DE）：IPG-DALT等2.图像分析系统：ELSIE4&8、gellabI&II等3.蛋白质鉴定方法：氨基酸分析、肽质量指纹图谱、氨基酸分析与PMF联合、序列标签途径、N端Edman降解蛋白与微量测序、MS微量测序等4.数据库设置与检索系统基本路线：样品制备与分离、图像分析、蛋白质成分的分析与鉴定、数据库检索八、基因功能研究方法以及各种方法的优缺点。九、什么是蛋白的翻译后修饰？目前鉴定蛋白质磷酸化的主要技术手段有哪些？肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。抗体法：主要采用磷酸化蛋白质抗体富集磷酸化蛋白；专一性强、效率高。2）离子交换色谱：离子交换色谱的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。可分为强阳离子交换色谱和强阴离子交换色谱十、实验设计题（共30分）根据蛋白质组学研究方法，结合自己感兴趣的研究方向，设计一个相关蛋白质组学实验。（包括研究意义、国内外研究现状及参考文献、研究方法及流程、预期结果）