乳腺上皮细胞原代培养

奶牛乳腺上皮细胞原代培养青岛农业大学产科实验室杨文浩实验材料：PBS，青链霉素，酒精棉，手术刀，组织镊，75%酒精，广口瓶，离心机，移液器及Tip头，胶原酶Ⅱ，DMEM/F12培养基，血清，细胞计数板，细胞培养皿，显微镜。口罩，工作服，手套。准备：准备实验材料，工作台内消毒。操作：1.酒精棉擦拭奶牛乳腺，手术刀横向切开乳腺2/3处，切取富含颗粒状腺泡的组织，置于含10%双抗的PBS中浸泡，清洗几次，将组织浸于75%酒精中消毒5min，再用PBS清洗，置于含双抗的PBS中4°C迅速运回实验室。2.将带回实验室的组织用PBS清洗，直至液体清亮。3.将清洗干净的组织于大平板中进行剪取，避免结缔组织和血管，用小手术剪刀一点点剪取颗粒状腺泡组织，浸泡于含双抗的PBS中，继续清洗直至清亮。4.弃去PBS，开始剪切组织，直至组织呈糜状，尽量剪的很细很小。于15ml离心管中加入PBS1500rpm/5min。清洗组织，至上清清亮。5.弃去上清，加入2倍于组织体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37°C振荡消化1.5小时左右，具体时间视消化情况而定。一般消化至组织边缘模糊，液体呈稠状时即可。6.加入PBS，2000/10min，弃上清，加入两倍组织体积的0.25%胰酶振荡消化15-30min。7.加入同等体积含20%FBS，10%双抗的DMEM/F12培养基终止消化，过200目筛，滤液3000rpm/3min离心得细胞沉淀。弃上清加入培养基重悬，调整细胞浓度，37℃,5%CO2培养箱培养。8.2天内尽量不要移动细胞，第三天第一次换液，以后每隔一天或两天换液一次，视细胞生长状况而定。9.继续培养待细胞生长至80-90%时进行1-2或3传代。10.新传代的细胞为第一代，最初培养的为原代。