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乳腺癌HER2FISH检测-检测意义、建议及标本准备HER2与乳腺癌乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的一种，正以每年3%～4%的速度急剧上升，已成为女性的第一杀手。临床上大约20-35%的浸润性乳腺癌存在HER2基因的扩增及蛋白的高表达。HER2基因(又名HER2/neu，c-erbB-2)位于17q12，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。HER2编码相对分子量185KD的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2阳性（过表达或扩增）的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。HER2检测方法有免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH）等。《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南2014版》均强调：FISH是检测HER2基因状态的金标准。一．检测意义1.判断预后：HER2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。2.指导治疗：HER2基因扩增的乳腺癌患者对内分泌治疗药物（如他莫昔芬）产生耐药。HER2基因扩增的乳腺癌患者对CMF方案不敏感，宜采用大剂量蒽环类药物和紫杉醇类药物方案；HER2基因扩增的乳腺癌患者明显受益于Herceptin（赫赛汀，2001年FDA批准上市）等靶向药物治疗。二．检测建议IHC和FISH检测HER2的状态一致性很高，但也存在着差异，数据统计如下表1和表2示，对于IHC2+样本必须要用FISH进一步确认结果；0、1+或3+，根据条件，可再做FISH验证。IHCFISH阳性率（%）阴性阳性01+2+3+89251432774562114156605.929.155.989.9表1：(2004)HER2AmplificationRatiosbyFluorescenceInSituHybridizationandCorrelationwithImmunohistochemistryinaCohortof6556BreastCancerTissues.ClinicalBreastCancer表2：2007年卫生部科教司牵头组织全国73家三级以上医院历时2年完成“荧光原位杂交技术（FISH）用于乳腺癌患者Her-2检测的临床研究”课题，检测标本达3368例因此，《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南（2014版）》均建议先进行HER2蛋白的IHC检测，IHC2+样本进行ISH（FISH、DISH或CISH）检测。《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》三．样本准备：1．标本类型：(1)手术切除标本；(2)粗针穿刺活检标本；(3)活检标本。2．标本固定：所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内固定）。固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6—72h为宜。3．固定液类型：4％中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。4．组织切片：(1)切片厚度3-5um；(2)应有HE染色切片作为对照。四．临床上哪些患者需要进行HER2检测1.所有乳腺原发性浸润癌都应进行HER2检测；2.只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行HER2检测；3.如HER2检测结果为阴性，但疾病复发且生物学行为提示可能为HER2阳性肿瘤时，应重复HER2检测；4.如HER2检测结果与组织病理学特征不相符时，如组织学分级为I级的浸润性乳腺癌HER2阳性，应重复HER2检测。组织学1级的类型腺癌：•浸润性导管或小叶癌，ER和PR阳性•小管癌（至少90%为纯小管癌）•粘液癌（至少90%为纯粘液癌）•筛状癌（至少90%为纯筛状癌）•腺样囊性癌（至少90%为纯腺样囊性癌）且常为三阴性乳腺癌HER2FISH检测-判读一．信号观察流程1.首先在HE/IHC切片上确认肿瘤区域；2.在10×物镜下，于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构；3.在40×物镜下扫描整张切片，观察是否存在异质性，要求至少找到2个浸润癌区域，计数至少20个浸润癌细胞。满意的标本应是75%以上癌细胞核中有杂交信号；4.在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果进行信号计数，注意上下调整焦距，以免遗漏信号。二．实验失败、不能判读的情况1.因操作等原因，细胞核被损坏，边界不完整；2.组织过度消化，细胞核边界不完整，DAPI染色浅；3.组织消化不足，25%以上的细胞核无信号；4.自发荧光很强或细胞核分辨差，10%细胞核外有信号。三．计数要求1.计数区域可结合苏木精伊红染色进行肿瘤细胞标识；2.选择具较好核分界的区域，要求细胞核大小基本一致、边界完整，DAPI染色均匀、核无重叠，绿色着丝粒信号清晰；3.随机计数确定的肿瘤区域中20～30个细胞核中的双色信号，不要主观选择信号多的核计数；4.不要计数仅显示一种颜色信号的细胞核；5.避免计数分裂像的细胞核或被细胞核分裂及边界不完整核；6.如果2个同样大小的橘红信号之间距离不足一个常规橘红信号大小，只计为一个信号；7.若红、绿两信号的比值20或众多信号连接成簇时可不计数，视为基因扩增；8.若为临界值，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个观察者重新计数，如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明，或换其它方法或其它蜡块重新检测；9.若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算20～30个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释；10.判读时可以将乳腺组织中的正常细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞)的HER2信号和CSP17信号作为内对照。一些常见信号类型及计数方法[摘自乳腺癌HER-2基因检测试剂盒（FISH法）说明书—AbbottMoleularInc.]四．结果判读在清晰的肿瘤区域，按以上计数要求在至少20个核内计数GSPHER2（红色）和CSP17（绿色）信号，分别记录GSPHER2和CSP17的信号总数，再计算平均每个细胞HER2拷贝数、平均每个细胞CSP17拷贝数以及GSPHER2和CSP17比值。A．若HER2/CSP172.0，且平均HER2拷贝数/细胞4.0，HER2阴性；B．若HER2/CSP172.0，且平均HER2拷贝数/细胞6.0，但≥4.0时，HER2结果不确定；C．若HER2/CSP17≥2.0，或HER2/CSP172.0而HER2拷贝数/细胞≥6.0，HER2阳性。《乳腺癌HER2检测指南2014版》《乳腺癌HER2检测指南2014版》注：a：对于HER2/CSP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞4.0的病例是否应该视为FISH阳性目前尚存争议，建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的争议，建议临床医师参考免疫组织化学检测结果并与患者进行必要的沟通；b：见于均质、连续的浸润细胞，且占浸润癌的10％以上五．HER2FISH判读标准的变化《乳腺癌HER2检测指南2009版》判读标准：A．若HER2/CSP171.8，HER2阴性；B．若HER2/CSP17≥1.8，且2.2，HER2结果不确定；C．若HER2/CSP17≥2.2，HER2阳性。新旧判读标准的比较：①2014版新标准的截断值为2.0，2009版老标准的截断值为1.8和2.2；②2014版新标准不只是HER2/CSP17的比值，需结合HER2基因的拷贝数进行判读；2009版则仅根据HER2/CSP17的比值进行判读，不考虑HER2基因拷贝数。新旧判读标准衔接中可能出现的问题：①2014版新标准出现HER2检测结果不确定的情况会比2009版标准更少；②2014版新标准判读阴阳性结合了HER2基因的拷贝数，有些2009版标准判读结果为阴性的标本，如果HER2基因拷贝数≥6.0，2014版新标准则判为阳性。[《乳腺癌HER2检测指南2009版》与《乳腺癌HER2检测指南2014版》]乳腺癌HER2FISH检测-报告及结果解释一．报告要求《乳腺癌HER2检测指南2014版》要求检测报告包括如下内容：患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊/住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、探针信息、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(包括评估的细胞数量、平均HER2拷贝数/细胞、平均CSP17拷贝数/细胞、平均HER2拷贝数/平均CSP17拷贝数的比值)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。这里强调两个概念：17号染色体计数和HER2异质性。1.17号染色体数目：FISH双探针检测系统中加入CSP17探针的目的是为了在检测HER2基因的同时检测17号染色体数目，从而区分17号染色体的非整倍体与HER2基因扩增。近年来的研究显示17号染色体多倍体与CSP17多信号点（着丝粒区多点）是不同的概念。17号染色体多倍体较罕见，而部分乳腺癌中17号染色体上存在HER2基因和着丝粒区的共同扩增。越来越多的学者认为，与GSPHER2/CSP17比值相比，HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要。因此在HER2FISH检测结果中除报告GSPHER2/CSP17比值外，还应分别报告HER2拷贝数和CSP17的数值。2.HER2基因的异质性：浸润性乳腺癌中HER2表达或扩增可存在异质性。虽然HER2基因异质性的临床意义目前仍不明确，但它可导致IHC与ISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。在ISH计数之前，应观察整张切片或使用IHC确定可能存在HER2扩增的区域。需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌10％以上，就应明确报告为ISH阳性。在报告中可补充报告不同细胞群(10％)的计数值(包括计数的细胞总数、HER2拷贝数、CSP17数值、GSPHER2/CSP17比值)，并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。二．常见结果及解释FISH阴性（HER2无扩增），17号二倍体。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）＜2.0。FISH临界，17号多倍体（HER2基因伴随多拷贝）。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）＜2.0，但平均每个细胞HER2拷贝数为4.9个，介于4.0-6.0之间。FISH阳性，17号多倍体。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）＜2.0，但平均每个细胞HER2拷贝数为6.8个，大于6.0。FISH阳性，17号染色体二倍体。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）≥2.0。FISH阳性，17号染色体多倍体。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）≥2.0。FISH阳性，17号染色体单倍体。GSPHER2/CSP17（红色/绿色）≥2.0，平均每个细胞HER2拷贝数为2.0个，平均每个细胞CSP17拷贝数为1.0个。注：对于HER2/CSP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞4.0的病例是否应该视为FISH阳性目前尚存争议，建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的争议，建议临床医师参考免疫组织化学检测结果并与患者进行必要的沟通三．报告模板参考1.参考模板一2.参考模板二HER-2判读计数表计数日期：标本号：细胞数红:HER-2绿:CSP17细胞数红:HER-2绿:CSP17131232333434535636737838939104011411242134314441545164617471848194920502151225223532454255526562757285829593060HER-2总数：平均每个细胞HER-2信号数：CSP17信号总数：平均每个细胞CSP17信号数：HER-2/CSP17：计数人：复核人：