仔猪粪便中乳酸菌的分离鉴定及其抑菌特性的研究

仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究张素辉曹国文徐登峰王孝友蒋安摘要从健康仔猪新鲜粪便中分离到3株乳酸菌，并对其进行了属和种的生化鉴定，结果显示，菌株La与Lt均为嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus），Ls为乳酸乳杆菌（Lactobacilluslactis）。对分离的3株乳酸菌的代谢产物进行了体外抑菌试验研究，结果表明，3株乳酸菌的代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有较明显的抑制作用；对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次之，对大肠杆菌的抑菌效果相对较弱。仔猪腹泻是引起仔猪生长受阻和死亡的重要原因之一，一直是困扰养猪业发展的难题。据资料统计，我国仔猪死亡率为15％～25%，2周龄以内死亡率为26%，2～4周龄的死亡率为16%，断奶前后因腹泻死亡的数量占总死亡数量的49.11%[1]。以前常采用在断奶仔猪饲粮中添加抗生素的办法来控制腹泻，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了动物体内微生物菌群的平衡，增加了消化道疾病的发生。同时病原体的耐药性问题越来越严重，部分抗菌药物在畜产品中的残留对人类健康构成极大威胁。因此，研究和开发无毒、无副作用和无残留的生物药品已成为热点课题。近年来,微生态制剂越来越受到众多人士的青睐,微生态调节剂是根据微生态学原理,调整微生态平衡的制剂。微生态疗法是根据微生态学原理,用微生态制剂扶持和恢复肠道菌群的平衡以达到预防腹泻的目的。1998年AAFCO年鉴公布了43种可用作益生素的菌种,其中半数以上是乳酸菌(Lacticacidbaciteria)[2]。乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色。本研究的目的是从健康仔猪的新鲜粪便中分离出在体外具有广谱抑菌、杀菌效果好的乳酸菌菌株，从而为开发应用于防治仔猪腹泻性疾病的微生态制剂提供参考依据。1材料与方法1.1材料1.1.1样品健康仔猪新鲜粪便，采自多个规模化养猪场。1.1.2培养基增菌及分离培养基：改良的MRS培养基，其组成为牛肉膏1.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸出粉0.5g、葡萄糖1.5g、乳糖0.5g、5%半胱氨酸1.0ml、吐温-800.1ml、氯化镁0.05g、柠檬酸铁铵0.2g、硫酸锰0.005g、乙酸钠0.5g、琼脂粉1.4g、无水磷酸氢二钠0.2g、100ml蒸馏水，调pH值至5.4。微量生化鉴定管:购自杭州微生物试剂有限公司。1.2方法1.2.1菌株的分离在改良的MRS液体培养基中加入适量的新鲜仔猪粪便，富集培养24h后,用接种环取培养液划线接种于改良的MRS琼脂平皿中,37℃有氧培养48～72h,挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作纯培养，并进行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。1.2.2分离菌的鉴定挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌，作硝酸盐还原试验、明胶液化试验、过氧化氢酶试验，靛基质试验和硫化氢试验；作七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇和蔗糖发酵试验。1.2.3乳酸菌对常见肠道致病菌的抑菌试验乳酸菌新鲜培养液按2%(v/v)接种于MRS液体培养基中,静置培养18～24h,取适量培养液,5000r/min离心30min，吸取上清液备用。临床分离保存的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌经活化后,接种于普通肉汤中培养12h,用灭菌吸管分别吸取各菌液培养物0.5ml于普通营养平皿中,用L棒均匀涂布,待琼脂表面水分干燥后,在平板表面放置灭菌的牛津杯,取制备的乳酸菌上清液于牛津杯内测定其对常见肠道病原菌(大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)的抑菌活性,置37℃培养10h，观察并测定抑菌圈的大小。同时设立相应代谢产物pH值相同的MRS液体培养基作对照。判定标准为：抑菌圈直径4mm判定为不敏感；抑菌圈直径5～10mm判定为低度敏感；抑菌圈直径11～15mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感[3]。2结果2.1各菌株特征本试验分离得到3株乳酸菌，编号分别为La、Ls、Lt，其菌落特征、菌体形态及染色特征见表1。2.2各菌株的鉴定根据革兰氏染色镜检可知，La、Ls、Lt菌为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化试验表明，它们均不能利用硝酸盐、过氧化氢酶试验和靛基质试验呈阴性，不液化明胶，不产生硫化氢。依据这些菌株糖发酵试验的结果(见表2)，并参见《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[4]，最终鉴定为：菌株La为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，菌株Ls为乳酸乳杆菌（Lactobacilluslactis），菌株Lt为嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）。2.3乳酸菌代谢产物对常见肠道致病菌的抑菌试验结果（见表3）由表3可以看出,3株乳酸菌代谢产物对3株病原指示菌都有较强的抑制作用,所有菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径在18～23mm之间,各菌株抑菌圈直径由大到小依次为LsLtLa;对沙门氏菌的抑制效果相对较低,抑菌圈直径在14～17mm之间,各菌株抑菌圈直径由大到小依次为LsLaLt；对大肠杆菌抑菌圈直径在15～19mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为LsLaLt。比较La、Ls、Lt菌株对沙门氏菌抑菌效果发现，Ls菌株代谢产物的抑制效果最明显，其抑菌圈直径极显著大于La、Lt菌株（P0.01）；La菌株对沙门氏菌的抑制作用高于Lt菌株，差异显著（P0.05）。La、Ls、Lt菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均存在极显著差异（P0.01）。3讨论目前，许多报道显示,微生态制剂不但能提高机体的生长性能[5]，而且还能降低肠杆菌科细菌在胃肠道各部位定植水平而影响肠道菌群的微生态平衡[6]，专业人士越来越多地注意到饲喂乳酸菌微生态制剂能够影响肠道菌群的微生态平衡。VanSchie等(1987)认为,乳酸杆菌的乳酸和挥发性脂肪酸在降低肠杆菌科细菌,如沙门氏菌在肠道定植具有重要作用[7]。乳酸菌在培养过程中可以产生有机酸(如挥发性脂肪酸、乳酸、丁酸、醋酸等)、双乙酰、过氧化氢、细菌素等化合物，这4个要素均能独自地或共同地作用于胃肠道菌群，这些混合物的分子量、生物化学性质、抑菌范围各不相同。人们对乳酸菌益生素的研究主要集中在采用新方法分离或开发新的益生素菌种上。陈世琼等认为，从菌种的安全性以及对宿主肠道的粘附性考虑，益生素菌种最好采用分离自宿主肠道优势菌中的优良菌种；另外，为节约生产和技术成本，应从宿主体内分离耐氧的菌种[8]。当然也可使用改造后仍然安全的菌种，但需作毒理学试验验证其安全性。本研究采用改良的MRS培养基，因含有高浓度的乙酸盐离子，低pH值(5.4)，并有刺激因子吐温-80，可抑制其它许多微生物的生长，起到选择培养的作用，因而能从粪便这样的复杂区系中选择培养出乳酸菌。在整个培养过程中均采取有氧培养，分离出的乳酸菌为兼性厌氧菌，为今后的研究和生产减去了较为复杂的厌氧培养条件。乳酸菌的代谢产物通过影响有害菌的定植粘附及抑制其生长而达到保护机体的作用[9]，这些代谢产物可以是低分子量或者高分子复合物,后者被认为是质粒编码的蛋白质,即细菌素,目前已经有许多关于乳酸菌细菌素的报道[10，11]。本试验在筛选出1株乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis),2株嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的基础上，通过牛津杯平板扩散试验对所分离到的乳酸菌菌株进行体外抑菌试验，发现所分离的3株乳酸菌发酵上清液有较强的抑菌活性，而相同pH值条件下的MRS培养基液在相同条件下没有抑菌活性，从而排除了酸的作用。这与田召芳等(2003)[12]的研究结果相一致，说明乳酸菌代谢产物中可能含有细菌素等其它抑菌物质的存在。实验室及临床试验研究表明，乳酸菌对肠道细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等引起的肠道感染有拮抗作用[13]，分离乳酸菌的抑菌试验也证实了这一论点，尤其是对致病性大肠杆菌有抑菌活性，可以作为益生素制备用菌株，本研究为开发应用该分离乳酸菌提供了参考依据和菌种保证。