五分子生物学诊断技术

分子生物学诊断技术vvv新近发展的分子生物学诊断技术即基因和核酸诊断技术，在寄生虫病的诊断中显示了高度的敏感性和特异性，同时具有早期诊断和确定现症感染等优点。本项技术主要包括DNA探针（DNAprobe）和聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）两种技术。一、DNA探针技术vvvDNA探针（或称基因探针）是指用同位素、生物素、酶或其他半抗原标记的特定DNA片段。在与DNA样本杂交过程中，借助上述标记物可探察出特异性或差异性DNA。双链DNA的变性和复性特点是本技术的基础。经加热，或在强酸、强碱作用下，双链DNA氢键被破坏，双股链分离，变成单链（此即变性）；而当条件缓慢变为中性或温度下降（50oC左右）时，氢键恢复，分开的两股单链又重新合为互补的双链结构（此即复性）。DNA探针分子杂交就是将样本DNA分子经上述条件处理后，使其变性为单链状态，固定在载体硝酸纤维膜上，再与经小分子标记的DNA探针单链分子混合，在一定条件下使它们互补杂交结合。将未杂交的成分洗脱后，标记物显色，即可观察结果。vvv目前，DNA探针已用于疟原虫、隐孢子虫、贾第虫、锥虫、巴贝斯虫、弓形虫、丝虫、血吸虫、棘球蚴、猪带绦虫、肝片吸虫和猪囊虫等虫种的鉴定和相应疾病的诊断上。vvv基因芯片技术（genechip）是20世纪90年代由基因探针技术发展而来的一项新技术。它将集成电路、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、荧光标记探针等技术结合为一体，使众多的寡核苷酸探针有规律地排列在硅片上（探针密度可达105/cm2），用其可与带有荧光标记的DNA样品杂交，再通过计算机分析荧光信号获得待测DNA样品的序列信息。基因芯片技术大大提高了基因探针的检测效率。在寄生虫学领域，本技术还处于研究之中，目前线虫基因组芯片业已问世。二、PCR技术vvvPCR是在引物介导下特异性扩增DNA的技术。它包括模板DNA热变性解链—引物与模板DNA退火—引物延伸3个步骤的循环过程。其基本原理是在实验条件下，根据温度的变化控制DNA解链和退火（引物与模板DNA结合），在引物启动和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定区域内的DNA链。上述“解链—退火—延伸”3个连续步骤为一个循环。经过20～30个循环反应，可使引物特定区段的DNA量增加至少105倍。vvv此外，PCR具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、样品处理简单等优点。反应过程可在PCR仪内自动进行。除常规PCR外，还有诸如RT-PCR、巢氏PCR、复合PCR、非对称PCR和免疫PCR等多种PCR技术。vvv目前，PCR技术多用于寄生虫病的基因诊断，分子流行病学研究和种株鉴定、分析等领域。已应用的虫种包括利什曼原虫、疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、阿米巴、巴贝氏虫、旋毛虫、锥虫、隐孢子虫、贾第虫、猪带绦虫和丝虫等。