五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析

中国组织工程研究第20卷第11期2016–03–11出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch11,2016Vol.20,No.11P.O.Box10002,Shenyang110180李建国，男，1971年生，河北省涉县人，汉族，2005年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事脊柱相关疾病与急救医学研究。通讯作者：胡成栋，博士，主任医师，硕士生导师，邯郸市中心医院骨二科，河北省邯郸市056001中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)11-01570-07稿件接受：2015-12-28，李盼2，3，4，尹合勇3，5，刘曦2，周玉军2，李海涛2，李彦飞2，王飞2，胡成栋2(1邯郸市涉县医院急诊科，河北省邯郸市056400；2邯郸市中心医院骨二科，河北省邯郸市056001；3解放军总医院骨科研究所，北京市100039；4河北医科大学，河北省石家庄市050011；5南开大学医学院，天津市300073)引用本文：李建国，李盼，尹合勇，刘曦，周玉军，李海涛，李彦飞，王飞，胡成栋.五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析[J].中国组织工程研究，2016，20(11):1570-1576.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.008ORCID:0000-0001-6164-7359(胡成栋)文章快速阅读：文题释义：玻璃化冻存方法：采用高浓度冻存溶液单步骤快速降温，溶液逐渐转变为玻璃样无定形体，组织在保存过程中细胞内外不形成冰晶，可避免细胞结构的破坏，有效保存细胞的活性。髓核：髓核为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间，是乳白色半透明胶状体，富于弹性，由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。摘要背景：冻存椎间盘可为同种异体椎间盘移植创造条件，传统的低温冷冻法常导致细胞内外冰晶形成从而造成细胞损伤，玻璃化冻存法可避免冻存过程中细胞内外形成冰晶而得到广泛应用，然而玻璃化法冻存椎间盘在内外文献中却少见报道，冻存试剂对髓核细胞的毒性研究也比较少见。目的：分析5种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对于兔髓核细胞的毒性作用，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂。方法：选取目前最常用的5种玻璃化冻存试剂：二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用单一5种、任意2种及任意3种玻璃化冻存试剂互相组合成各10种冻存试剂组合共25种。用CCK-8和FDA/PI两种方法检测髓核细胞的细胞存活率。用统计学方法对所得数据进行统计分析，选出对髓核细胞毒性较小的玻璃化冻存试剂组合方案。结果与结论：①两种检测方法检测结果：5种玻璃化试剂对髓核细胞的毒性由小到大依次为：乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。②2种冻存试剂组合和3种冻存试剂组合的毒性均比组成该组合溶液的任意一种单一玻璃化冻存试剂小。③组合试剂中，含有乙二醇或丙三醇的2种冻存试剂组合或3种冻存试剂组合毒性均较小。故玻璃化冻存椎间盘可选用包含乙二醇和(或)丙三醇的玻璃化组合试剂。关键词：组织构建；组织工程；玻璃化；毒性；冻存试剂；椎间盘；髓核细胞；存活率主题词：椎间盘；存活率；药物毒性基金资助：邯郸市科学技术研究与发展计划项目(0928108052)分析玻璃化冻存试剂单独或组合应用对兔髓核细胞的毒性作用主要观察指标实验旨在分析不同玻璃化冻存试剂单独或组合应用对于兔髓核细胞的毒性作用，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂选取常用的玻璃化冻存试剂单独或组合应用：采用单一、任意2种及任意3种玻璃化冻存试剂互相组合成25种冻存试剂组合5种二甲基亚砜甲酰胺乙二醇丙二醇丙三醇(1)5种单一冻存试剂处理髓核细胞的FDA/PI染色结果分析(2)不同组合玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后的FDA/PI染色细胞存活率分析(3)不同组合玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后的CCK-8细胞活性检测结果分析结果分析：李建国，等.五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1571:HuCheng-dong,M.D.,Chiefphysician,Master’ssupervisor,SecondDepartmentofOrthopedics,HandanCentralHospital,Handan056001,HebeiProvince,ChinaFivekindsofvitrifiedcryoprotectants:toxicityoftheiraloneorcombinationtonucleuspulposuscellsLiJian-guo1,LiPan2,3,4,YinHe-yong3,5,LiuXi2,ZhouYu-jun2,LiHai-tao2,LiYan-fei2,WangFei2,HuCheng-dong2(1EmergencyDepartment,ShexianCountyHospital,Handan056400,HebeiProvince,China;2SecondDepartmentofOrthopedics,HandanCentralHospital,Handan056001,HebeiProvince,China;3InstituteofOrthopedics,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100039,China;4HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,HebeiProvince,China;5SchoolofMedicine,NankaiUniversity,Tianjin300073,China)AbstractBACKGROUND:Transplantationofallogeneicintervertebraldisccanbefacilitatedbythecryopreservationoftheintervertebraldisc.Butthetraditionalcryopreservationmethodsalwaysleadtotheappearingoficecrystalsinsideandoutsidethecellswhichcancausecellularinjury.Thevitrificationmethodthatcanavoidtheformationoficecrystalshavebeenwidelyappliedinthecryopreservationfield.However,onlyafewreportshaveassessedthevitrifiedcryopreservationoftheintervertebraldisc,andthetoxicityofcryoprotectantstothenucleuspulposuscellshavenotbeenfullyexplored.OBJECTIVE:Todeterminetheorderoftoxicityoffivecommonlyusedcryoprotectantsthatareusedaloneorincombinationtorabbitnucleuspulposuscells,andtoselecttheoptimalcryoprotectantforthevitrificationoftheintervertebraldisc.METHODS:Wechosefivemostcommonlyusedcryoprotectantsincludingdimethylsulphoxide,formamide,ethyleneglycol,propyleneglycolandglycerol.Then,5singlecommonlyusedcryoprotectants,10mixedagentscontainingany2commonlyusedcryoprotectants,and10mixedagentscontainingany3commonlyusedcryoprotectantswereformulated.Cellviabilityofnucleuspulposuscellswasdeterminedusingcellcountingkit-8andfluoresceindiacetate/propidiumiodidemethod.Alldataobtainedwereanalyzedstatisticallytochoosetheappropriatecombiningschemewithlesstoxicity.RESULTSANDCONCLUSION:Theorderofthetoxicityofthesefivecommonlyusedcryoprotectantsfromlowtohighwasethyleneglycol,glycerol,formamide,dimethylsulphoxide,andpropyleneglycol.Thetoxicityofthecombinedagentscontainingtwoorthreecommonlyusedcryoprotectantswaslowerthanthatofanycommonlyusedcryoprotectantsthatwereusedtoformulatethem.Thetoxicityofthemixedagentsthatcontainedethyleneglycolorglycerolwaslowerthanthatofanyothermixedagents.Sowecanchoosethemixedcryoprotectantsthatcontainethyleneglycoland(or)glycerolforthevitrificationoftheintervertebraldisc.Subjectheadings:IntervertebralDisk;SurvivalRate;DrugToxicityFunding:HandanScienceandTechnologyResearchandDevelopmentProject,No.0928108052Citethisarticle:LiJG,LiP,YinHY,LiuX,ZhouYJ,LiHT,LiYF,WangF,HuCD.Fivekindsofvitrifiedcryoprotectants:toxicityoftheiraloneorcombinationtonucleuspulposuscells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(11):1570-1576.0引言Introduction目前，在器官移植、人工授精、病毒研究等领域中，冻存细胞、组织或器官是一项非常重要的基本技术[1]。临床和科研中最常用的冻存方法有慢速冷冻保存法和玻璃化冻存法[2]，玻璃化冻存法是指采用高浓度冻存液单步骤快速降温，使冻存液直接进入玻璃态，从而避免冻存过程中产生冰晶损伤细胞。而慢速冷冻法采用分步降温，操作复杂，且冻存过程中产生冰晶较多，容易损伤细胞。玻璃化冻存法相对于慢速冷冻法是一个新颖、操作简单、成本低廉的方法[3]。目前玻璃化冻存