亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响

中国组织工程研究第20卷第11期2016–03–11出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch11,2016Vol.20,No.11ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1577·研究原著·李艳玲，女，1976年生，河北省保定市人，汉族，2007年河北医科大学毕业，硕士，副主任医师，副教授。研究方向为皮肤性病科及皮肤外科方面。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)11-01577-07稿件接受：2016-01-22亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响李艳玲，胡玉贤，张晓光，王凌(河北医科大学第二医院皮肤性病科，河北省石家庄市050000)引用本文：李艳玲，胡玉贤，张晓光，王凌.亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(11):1577-1583.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.009ORCID:0000-0002-1962-373X(李艳玲)文章快速阅读：文题释义：人永生化角质形成细胞株：HaCaT细胞来源于正常成人皮肤角质形成细胞,通过体外在低钠离子浓度和室温条件下长期培养而自发永生化建立的角质细胞系。目前对于HaCaT细胞自发永生化的确切机制尚不了解，但已有的研究表明这是一个逐渐发生的多步骤基因改变的过程，主要是细胞沉默基因的失活和永生化基因的激活。亚砷酸钠颗粒：砷以不同晶格结构的类金属形式存在于自然界，但更容易发现的形式是砷化物与砷酸盐化合物。砷与其化合物被运用在农药、除草剂、杀虫剂与许多种的合金中，可通过饮水、食物和空气等进入人体。大量流行病学调查表明，长期摄入砷化物可引起多种癌症，其中最常见的是皮肤癌、肺癌和膀肮癌，因此，砷化物已被国际癌症协会确认为人类确定致癌物。摘要背景：有研究发现亚砷酸钠可以引起HaCaT细胞的恶性转化，并具有致瘤性，但关于低浓度亚砷酸钠是否引起HaCaT细胞发生恶性转化的研究不多。目的：分析亚砷酸钠对HaCaT细胞恶性转化的影响。方法：将HaCaT细胞加入不同浓度的亚砷酸钠进行培养，MTT测定亚硫酸钠对HaCaT细胞形态和增殖能力的影响，流式细胞术测定亚硫酸钠对HaCaT细胞周期的影响，软琼脂集落形成实验测定亚硫酸钠对HaCaT细胞克隆形成能力的影响。结果与结论：①5mol/L亚砷酸钠对HaCaT细胞生长没有影响，但10和50mol/L亚砷酸钠抑制HaCaT细胞生长。②HaCaT细胞经0.1mol/L亚砷酸钠处理后，传代培养至第20代时，HaCaT细胞的形态没有明显改变，第25代时，细胞体积增大，有多个核仁，有不断增殖趋势。③与原代细胞相比，经0.1mol/L亚砷酸钠处理后传至第15及25代HaCaT细胞S期细胞和G2/M期细胞所占比例增加，增殖能力增强，克隆形成率增加，且第25代HaCaT细胞的增殖能力和克隆形成率高于第15代。④实验结果说明，高浓度亚砷酸钠降低HaCaT细胞的活力，低浓度亚硫酸钠对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞的细胞形态、细胞周期、增殖能力以及克隆形成能力均有一定的影响，随着传代的增加，人永生角质形成细胞增殖能力和克隆形成能力不断增强。关键词：组织构建；组织工程；亚砷酸钠；人永生化角质形成细胞；恶性转化；细胞形态；细胞周期；增殖；克隆主题词：细胞增殖；砷；细胞转化,肿瘤基金资助：河北省科技计划项目(12277745)亚砷酸钠颗粒如何影响人永生化角质形成细胞株恶性的转化？检测指标：(1)观察细胞形态并用MTT测定亚硫酸钠对HaCaT细胞增殖能力的影响(2)流式细胞术测定亚硫酸钠对HaCaT细胞周期的影响(3)软琼脂集落形成实验测定亚硫酸钠对HaCaT细胞克隆形成能力的影响亚砷酸钠人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞干预实验结果：(1)不同浓度亚砷酸钠对HaCaT细胞活力的影响有差异(2)低浓度亚硫酸钠对HaCaT人永生化皮肤角质形成细胞的细胞形态、细胞周期、增殖能力以及克隆形成能力均有一定的影响(3)随着传代的增加，人永生角质形成细胞增殖能力和克隆形成能力不断增强李艳玲，等.亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响P.O.Box10002,Shenyang110180(DepartmentofDermatology,SecondAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:StudieshavefoundthatsodiumarsenitecancausethemalignanttransformationandtumorigenicityofHaCaTcells,butwhetherlowconcentrationsofsodiumarsenitecancausethemalignanttransformationisrarelyreported.OBJECTIVE:Tostudytheeffectofsodiumarseniteonthemalignanttransformationofhumanimmortalizedkeratinocytecelllines.METHODS:HaCaTcellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofsodiumarsenite.MTTassaywasusedtodeterminetheeffectofsodiumarseniteonHaCaTcellmorphologyandproliferation,flowcytometryusedtodetecttheeffectofsodiumarseniteonHaCaTcellcycle,andsoftagarcolonyformationexperimentsassayusedtodeterminetheeffectofsodiumarseniteonHaCaTcellcolonyformationcapacity.RESULTSANDCONCLUSION:HaCaTcellsgrewwellwhentheconcentrationofsodiumarsenitewas5mol/L,butthecellgrowthwasinhibitedunderinterventionwith10and50mol/Lsodiumarsenite.HaCaTcellstreatedwith0.1mol/Lsodiumarsenitewerepassagedtothe20thgeneration,andcellmorphologyhadnonotablechanges;cellsatpassage25exhibitedenlargedsizeandmultiplenucleoli,whichhadacontinuedproliferationtrend.Comparedwiththeprimarilyculturedcells,0.1mol/Lsodiumarsenite-treatedHaCaTcellsatpassages15and25hadanincreasedproportionatSphaseandG2/Mphase,withstrengthenedproliferationabilityandincreasedcolony-formingefficiency,andmoreover,theproliferationabilityandcolony-formingefficiencyofpassage25cellswerehigherthanthoseofpassage15cells.TheseexperimentaldatashowthathighconcentrationsofsodiumarsenitereduceHaCaTcellviability,andlowconcentrationsofsodiumsulfitehaveacertaininfluenceonthemorphology,cellcycle,proliferationabilityandcolony-formingefficiencyofHaCaTcells,andmoreover,theproliferationabilityandcolony-formingefficiencyofhumanimmortalizedkeratinocyteswillbestrengthenedwiththeincreaseofpassage.Subjectheadings:CellProliferation;Arsenic;CellTransformation,NeoplasticFunding:theScientificPlanProjectofHebeiProvince,No.12277745Citethisarticle:LiYL,HuYX,ZhangXG,WangL.Effectofsodiumarseniteonmalignanttransformationofhumanimmortalizedkeratinocytecelllines.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(11):1577-1583.0引言Introduction砷是一种有毒的化学元素[1-3]，在自然界中以不同的晶格结构存在，常见的是砷酸盐化合物以及砷化物，在多种合金和农药中有广泛应用[4-6]。砷误食可致急性砷中毒，砷的长期暴露常引起慢性砷中毒。此外，砷化物还有致癌作用，长期摄入容易诱发皮肤癌、膀胱癌以及肺癌等[7-9]。砷化物在人体中致癌性的研究有一定困难，在体外对细胞转化进行研究为砷化物致癌性的研究提供了新的思路。细胞转化是指有害物质对正常细胞进行处理后，使正常细胞发生癌症细胞性质的改变[10-11]。皮肤角质形成细胞HaCaT细胞在一定条件下能够自发永生化[12-15]。作者拟通过对HaCaT细胞进行培养，观察不同浓度亚砷酸钠对其活力的影响。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照细胞学实验。1.2时间及地点实验在2014年5月至2015年7月在河北医科大学第二医院实验室完成。1.3材料人永生化皮肤角质形成细胞株HaCaT由上海细胞生物所提供。亚砷酸钠购自美国Sigma公司，以蒸馏水45mL溶解11.7g亚砷酸钠，滤膜过滤，保存备用。1.4实验方法1.4.1细胞培养与传代将HaCaT细胞培养于DMEM培养基(美国Sigma公司)中，每2d换液1次，待细胞生长至90%以上融合时，进行传代培养，胰蛋白酶(美国Gibco公司)进行消化，加入DMEM培养液终止消化，吹打细胞制成HaCaT单细胞悬液。李艳玲，等.亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞株恶性转化的影响ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH15