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本科学生综合性实验报告学号：094120275姓名：陈小华学院：生命科学学院专业、班级：09应用生物教育B班实验课程名称：胡萝卜的细胞悬浮培养及体细胞胚诱导教师：杨世忠开课学期：2011至2012学年第二学期填报时间：2012年6月15日云南师范大学教务处编印一．实验设计方案实验序号实验二实验名称胡萝卜的细胞悬浮培养及体细胞胚诱导实验时间2012年5月-6月实验室生物院组培实验室（一）实验目的1、熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。2、进一步熟悉、规范无菌操作技术。3、设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。4、掌握胚状体诱导发生的一般技术。（二）实验原理及实验流程或装置示意图1、实验原理(1)细胞悬浮培养是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。其主要优点是：能大量提供比较均匀一致的细胞，也就是同步分离的细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。（2）要进行细胞悬浮培养和体细胞胚的诱导实验就得获得单细胞，单细胞的获得的方法有由完整的植物器官分离和由培养组织中分离单细胞。其中，前者又包括机械法和酶解法两种。机械法广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。和酶解法相比，用机械法分离细胞两个明显的优点：①细胞不受酶的伤害；②不会发生质壁分离。这点对生理和生化研究来说是很理想的。本实验采用液体培养基进行震荡培养获得单细胞，实验材料为胡萝卜愈伤组织。其中，振荡至少有两种作用：可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。但因注意，摇床（旋转式摇床、慢速转床和自旋式培养架）和适当的三角瓶就可以进行振荡培养。转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。（3）细胞悬浮培养有三种类型：分批培养、半连续培养以及连续培养。分批培养(batchculture)是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。连续培养(continuousculture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。（4）细胞悬浮培养的培养基从理论上讲，能形成生长快、疏松愈伤组织的培养基一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。旺盛生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐迅速地被利用，以致使无机磷酸盐成为了一个限制生长的因素。此外，培养基的pH值和启动密度也是不容忽视的。pH值可能随细胞生物产量的增加而改变。需要监测和调整悬浮培养物中的pH值。启动低密度细胞培养时，要条件培养基。（5）由悬浮细胞再生植株的途径：由悬浮细胞直接形成体细胞胚：先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。胚状体方式：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体形成在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。在生长素比细胞分裂素比值高的时候使细胞进行增殖。水解酪蛋白属于铵态氮，对胚状体诱导起重要作用。（6）悬浮培养中细胞生长的测定常用方法：细胞计数、细胞密实体积(packedcellvolume,PCV)、细胞鲜重、细胞干重、细胞有丝分裂的指数。（7）培养细胞活力的测定常用方法：相差显微术法、四唑盐还原法(TTC法)、荧光素二乙酸酯法(FDA法)、伊凡蓝染色法。2、实验流程（三）实验设备及材料1、主要实验用具和仪器冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯。PH试纸、药勺、称量纸、灭菌锅、摇床、倒置显微镜、过滤筛、培养皿等。2、药瓶和试剂硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4-D、NAA（a-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、弄盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、水解酪蛋白、氯化汞等。3、实验材料：健康疏松的胡萝卜愈伤组织。悬浮培养基及诱导培养基的配制器械消毒灭菌振荡培养获取合格的单细胞细胞进行体细胞胚的诱导实验结果观察记录悬浮培养物的镜检愈伤组织接种(四)、实验方法步骤1、培养基的配制（具体步骤不再赘述）（1）、继代培养基配方如下：MS基本培养基＋0.1mg/L6-BA＋2mg/LNAA+200mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖（2）、诱导培养基配方如下：MS基本培养基＋200mg/L水解酪蛋白＋3％蔗糖2、细胞悬浮培养（1）相关工具的消毒灭菌。（2）在无菌条件下，用镊子夹取胡萝卜根的愈伤组织，置于盛有虑纸的无菌培养皿当中，将愈伤组织切成适当大小，同样也可以将愈伤组织捏碎，用解剖刀挑取愈伤组织接种于细胞悬浮培养基中。接种的愈伤组织量可略多一点。（3）接种后将三角瓶置于摇床上，转速一定，在25-27摄氏度下培养。3、继代培养。（由于时间关系以及条件有限，本次实验只进行了一次悬浮培养）在接种两个星期之后继代。继代方法是：先用孔径为100um的无菌尼龙滤筛将培养物滤去。除去滤筛上的愈伤组织碎块和大的细胞团。4、通过镜检查看实验结果。用一定规格的无菌尼龙滤筛将培养物过滤，滤出含单细胞的液体盛于一洁净的培养皿内。在倒置显微镜下观察单细胞。（理论上还应对培养物中进行单细胞计数以及活力测定，但因条件有限，未能完成。这是本次实验的一大遗憾。）5、体细胞胚的诱导。（由于时间关系，该步未来得及完成。）将镜检合格的细胞过滤培养液转移到胚状体诱导培养基当中，培养瓶封口后置于黑暗条件下培养。一段时间后，在倒置显微镜下进行镜检，观看愈伤组织的诱导情况。（五）、注意事项1、培养所有的培养基应尽可能新鲜，以免造成污染。2、本实验依然需要注意无菌操作技术。关于这一点由于前面已经讲的太多，这里就不再重述。3、震荡可以防治细胞缺氧死亡，防治大的细胞团的形成。但应注意，转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。4、继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。5、选材时应尽量选择较为疏松的组织。6、后期对体细胞胚诱导时，应注意各生长调节物质的使用。7、对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。（六）、参考文献[1].李浚明，朱登云.植物组织培养（第3版）.中国农业大学出版社.2005,2.[2].王连清主编.植物组织培养.北京：中国农业出版社，2002.[3].潘瑞炽主编.植物组织培养（第三版）.广州：广东高等教育出版社，2003.[4].曹孜义，刘国民主编.实用植物组织培养技术教程.兰州：甘肃科学技术出版社，2001.[5].郭勇，崔堂兵，谢秀帧编著.植物细胞培养与应用.北京：科学出版社，2004.二．实验报告（一）、实验现象及观察结果1、细胞悬浮培养（1）从摇床上取出培养瓶，可见瓶内液体呈浅黄色，不太澄清，略显浑浊，有的同学的瓶内偏红色，初步推测，有染菌的嫌疑。用过滤筛对震荡培养物过滤后，经倒置显微镜观察，可以看到，过滤后的细胞悬浮培养液中有单细胞以及多个细胞组成的细胞团块，细胞呈球状或者是有一定的立方体型，细胞较透明，其余的有一些细胞的碎屑分布在悬浮培养液当中。（2）理论上，还应对单细胞进行计数及对细胞活力进行测定，但因时间关系，未能完成。2、体细胞胚胎发生由于时间关系，该过程未能进行实验。（二）、对实验现象、实验结果的分析及其结论1、本实验结果经镜检看到的单细胞较少，视野中多为细胞团块，此外，还有明显的细胞碎片。这可能是实验所用愈伤组织材料不够疏松所致。此外，摇床速度也可能对实验结果造成一定影响。2、由于条件有限，实验室仅有一台倒置显微镜，在利用倒置显微镜观察单细胞时，调适过程中，大部分同学都不够细心，不耐烦，以致许多同学尚未观察到满意的结果就草草结束实验。3、利用愈伤组织材料做细胞的悬浮培养的过程中，愈伤组织材料的选择十分重要，本实验用前一次实验获得的愈伤组织做材料，由于愈伤组织材料是自己做的，故具有较高的可靠度和可信性。4、有的同学培养物发现被污染，这可能是因培养基放置时间太长，或接种过程不严谨所致。5、据了解，本次实验结果均不太理想。这可能是由于继代培养次数太少引起的，以后做实验有必要增加继代培养的次数，以便得到较多的单细胞。（三）、实验总结本次实验没有出现什么问题，基本成功。实验过程中，本小组各成员都积极参与，合作有序，操作严谨，共同完成了培养基的配制任务，这也是我们本次实验取得成功的基础之一。。悬浮培养的结果基本正常。但在镜检过程中由于条件有限，实验室仅有一台倒置显微镜，在利用倒置显微镜观察单细胞时，调适过程中，大部分同学都不够细心，不耐烦，以致许多同学没有观察单细胞。我在镜检时，一开始也无法快速找到最好的视野，以致无法观察到清晰的细胞。在老师的指导下，才观察到了一些细胞团和小细胞。本次实验的一大遗憾就是未能将细胞活力测定得到的单细胞进行体细胞胚的诱导。尽管如此，本次实验还是让我们学到了很多技能性的知识，而且，通过对实验结果的认真反思和分析、总结，我们学到了许多拓展性的知识。总之，本次实验的学习，让我们深刻体会到了合作学习的重要性，以及严谨的科学态度的重要性。在今后的学习中我们会更加珍惜这样的学习机会，并尽力做到最好的。教师评语及评分：签名：年月日