产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离

实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1.学习从各种样品中分离微生物的操作技术2.掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3.学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4.掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。1.枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。2.枯草芽孢杆菌的产酶特征。利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。3.枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。4.枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。三、实验材料1.样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取）2.培养基①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100mL/组，其中20mL液体培养基/250mL△中（内装玻璃珠10颗）；50mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。组成：牛肉膏0.5%蛋白胨1%NaCl0.5%pH7.2～7.4121℃，灭菌20min②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200mL/500mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）*酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。pH6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。③生理盐水：0.85%NaCl水溶液，9mL/支×10支④其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL，500mL规格）、革兰氏染色液等。四、实验内容1.采样学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。2.增殖培养（富集培养）一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的生长受到抑制，而对某些微生物可促进它们的生长，从而达到分离所需微生物的目地，这种培养称为增殖培养。取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。然后30℃，150r/min，振荡培养24h。取样镜检形成芽孢的情况。3.涂布分离组分配方要求(%)母液浓度(%)各成分的取量（mL）/200mlKH2PO40.0363.62MgSO4·7H2O0.0552ZnCl20.00140.142Na2HPO4·7H2O0.10710.72NaCl0.0161.62CaCl20.00020.022FeSO40.00020.022*酪素0.4420Trypticase0.0050.52琼脂2.0将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。然后取1mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。4.纯化用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。5.纯种鉴定菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。②产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使用。五、结果与讨论绘制菌体形态图，计算不同单菌落的H/C。六、实验任务获得的H/C比值大、产蛋白酶活力高的枯草芽孢杆菌菌株。七、教学重点及难点1．掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法2．掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法八、教学方法和手段详细讲解和板书，并结合实物进行讲解和示范，强调操作注意事项。实验二微生物的诱变育种一、教学目标及基本要求：1.理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应；2.学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。二、实验原理紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。三、实验材料1.菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2.培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9）3.其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。四、方法与步骤1.菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。2.细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。3.活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。菌体浓度(个/ml)=菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数4.诱变处理(1)取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。(2)开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。(3)取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。将结果填入表1。表1紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响照射时间稀释度平板菌落(个/ml)细胞浓度平均值N1(个/ml)存活率(%)(N1/N0)平板1平板2平板315s①②③30s①②③45s/90s0s(对照)①②③100五、结果与讨论实验选择诱变时间时，全班共同绘制一条致死曲线，每个组或几个组选择一个诱变处理时间，最后统一进行绘制。六、实验任务绘制细胞存活率曲线，选择合适的诱变剂量。七、教学重点及难点紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。八、教学方法和手段详细讲解和板书，并结合实物进行讲解和示范，强调操作注意事项。实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求：理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。三、实验材料1.菌种枯草杆菌（B.subtilis）。2.培养基(1)细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。(2)细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。(3)无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。(4)二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。(5)限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。3.溶液(1)无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。(2)水溶性维生素混合液。(3)核酸水解液：取2gRNA，加入15ml1mol/LNaOH；另取2gRNA，加入15ml1mol/LHCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。4.其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。四、实验内容1.菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。2.对数培养取1ml培养液转接于另一只装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养6~8h，使细胞处于对数生长状态。3.细胞悬浮液的制备(1)取10ml培养液，离心（3500r/min，10min）收集菌体，菌体用生理盐水离心洗涤2次，最后将菌体充分悬浮于11ml生理盐水中，调整细胞浓度108个/ml。(2)取1ml菌悬液以倾注法进行活菌计数，测定细胞悬浮液的菌体浓度。4.诱变处理取剩余的10ml细胞悬浮液于直径90mm培养皿中（带磁棒），以紫外线照射60s。5.中间培养取1mlUV处理过的菌液于装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养过夜。6.淘汰野生型（青霉素法）(1)取10ml中间培养液，离心（3500r/min，10min）收集菌体，菌体用生理盐水离心洗涤2次，最后将菌体转