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山东医药2010年第50卷第22期16©1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.增殖和凋亡的影响及其机制探讨张继全,邱建武3,关宁,张晓健(辽宁医学院,辽宁锦州121001)摘要:目的观察人参皂甙单体Rh2(GS2Rh2)对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法用GS2Rh2处理人脑胶质瘤U251细胞,采用MTT法检测U251细胞增殖抑制率,流式细胞仪和AnnexinV2FITC/PI双染法观察U251细胞凋亡情况,TRAP2ELISA法检测U251细胞端粒酶活性,RT2PCR法检测U251细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果5、10、20、40、80μg/mlGS2Rh2组U251细胞增殖抑制率分别为20.42%、32.19%、45.09%、57.37%、73.82%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC30、IC50、IC70值分别为9.7、25.2、68.4μg/ml。FITC和PI荧光双参数点图显示实验组细胞分布区域与对照组相比出现明显改变,随着药物浓度的增加,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。9.7、25.2、68.4μg/mlGS2Rh2处理12、24、48、72h后U251细胞端粒酶活性随GS2Rh2浓度增加和作用时间的延长而降低。浓度为25.2μg/mlGS2Rh2作用24、48、72h的U251细胞hTERTmRNA与β2actin灰度值比为0.9649±0.0042、0.4018±0.0014、0.2978±0.0018,对照组为0.9764±0.0051。作用48、72hU251细胞hTERTmRNA与β2actin灰度值比与对照组相比P均0.05;作用48、72h者相比P0.05。结论GS2Rh2能够诱导人脑胶质瘤U25l细胞凋亡,抑制U25l细胞增殖。其机制与其抑制hTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。关键词:人参皂甙单体Rh2;胶质瘤;细胞增殖;细胞凋亡;端粒酶;人端粒酶逆转录酶中图分类号:R739.41文献标志码:A文章编号:10022266X(2010)2220016203Effectandmechanismofginsenoside2Rh2onhumangliomaU251cellproliferationandapoptosisZHANGJi2quan,QIUJian2wu,GUANNing,ZHANGXiao2jian(LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,P.R.China)Abstract:ObjectiveToobservetheeffectandmechanismofginsenoside2Rh2(GS2Rh2)onhumangliomaU251cellproliferationandapoptosis.MethodsHumangliomaU251cellsweretreatedwithGS2Rh2,theinhibitoryeffectwasexam2inedwithMTT.StainingwithAnnexinV2FITC/PIandflowcytometryanalysiswereusedtodetecttheapoptoticcells.TRAP2ELISAwasusedtodetectedtelomeraseactivityandRT2PCRwasusedtodetecttheexpressionofhTERTgene.Re2sultsTheapoptoticratewas20.42%inthegroupwith5μg/mlGS2Rh2,32.19%inthegroupwith10μg/mlGS2Rh2,45.09%inthegroupwith20μg/mlGS2Rh2,57.37%inthegroupwith40μg/mlGS2Rh2,73.82%inthegroupwith80μg/mlGS2Rh2.ThevalueofIC30,IC50,IC70were9.7,25.2,68.4μg/mlrespectively.FITCandPIfluorescencedual2pa2rameterpointmapshowedthattherewasasignificantlychangebetweentheregionaldistributionofexperimentalcellscom2paredwithcontrolgroup,andearlyapoptosis,lateapoptosisornecrosisofregionalcellsgraduallyincreasedwiththein2creaseofdrugconcentration.ThetelomeraseactivityofU251cellswhichtreatedwith9.7,25.2,68.4μg/mlGS2Rh2de2creasedwiththeconcentrationofGS2Rh2andthetreatmenttime.ThegreyratioofhTERTmRNAandβ2actininU251cellstreatedwith25.2μg/mlGS2Rh2for24,48,72hwere0.9649±0.0042,0.4018±0.0014,0.2978±0.0018respec2tively,anditwas0.9764±0.0051incontrolgroup.ConclusionsGS2Rh2caninducehumangliomaU251cellapopto2sis,inhibitecellproliferation.ItmayberelatedtoGS2Rh2decreasinghTERTgeneexpressionandinhibitingtelomeraseac2tivity.Keywords:ginsenoside2Rh2;glioma;proliferation;apoptosis;telomerase;humantelomerasereversetranscriptase文献报道人参皂甙单体Rh2(GS2Rh2)具有较强基金项目:辽宁省教育厅科研基金资助项目(2009A448)。3通讯作者的抗肿瘤生物活性,对卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、白血病以及人肺腺癌等肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用[1～4]。国外研究表明,这种抗肿瘤©1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关[5]。国内相关报道ELISA法。收集药物浓度为IC30、IC50、IC70作用12、较少。2009年3～7月,我们检测了GS2Rh2对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡及端粒酶活性、人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达的影响。现报告如下。1材料与方法1.1材料人脑胶质瘤U251细胞株,GS2Rh2DMEM培养基,胎牛血清,MTT、DMSO、RT2PCR试剂盒,AnnexinV2FITC/PI双染试剂盒,TRAP2ELISA试剂盒,多功能电泳仪,PCR仪,Biorad凝胶成像系统,流式细胞仪。1.2方法1.2.1U251细胞增殖抑制率的测算采用MTT法。取对数生长期U251细胞接种于96孔培养板(1×104/孔)。加入终浓度分别为0(对照组)、5、10、20、40、80μg/ml的GS2Rh2,每孔设4个复孔。37℃、5%CO2孵箱中培养48h。每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl,继续培养4h后加入DMSO150μl,24、48、72h的实验组和对照组U251细胞,分别加入200μl细胞裂解液,取上清液并根据试剂盒提供的引物和预设PCR程序进行端粒序列扩增,将扩增产物顺序进行杂交、显色处理后室温放置20min,最后加入100μl反应终止液,制备的样本用酶联免疫检测仪分别测450nm和690nm波长的OD值,两者差值代表细胞端粒酶活性。以U251细胞提取液于65℃加热10min后为阴性对照,以人胚肾293细胞株端粒酶提取液为阳性对照。1.2.4U251细胞hTERTmRNA的检测采用RT2PCR法。分别取对照组和浓度为IC50GS2Rh2作用24、48、72h的实验组U251细胞,提取各组细胞总RNA,逆转录制备cDNA,然后进行聚合酶链反应(PCR)。操作按试剂盒说明书进行。利用图像分析软件GeneTools分析各组hTERT、β2actin两条基因条带的灰度比。1.2.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件。酶联免疫检测仪570nm波长处测定吸收度OD值。数据用x－±s表示。两样本均数比较采用配对t检细胞增殖抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。绘制细胞增殖抑制曲线图,横坐标为GS2Rh2浓度,纵坐标为细胞抑制率,计算IC30、IC50、IC70。1.2.2U251细胞凋亡情况的观察采用AnnexinV2FITC/PI双染法和流式细胞术。收集浓度为IC30、IC50、IC70的GS2Rh2作用48h的实验组和对照组U251细胞。调待测细胞浓度为1×106/ml。取1ml细胞,1000r/min,4℃离心10min,弃上清,再加入1ml的冷PBS同法离心,弃上清,将细胞重悬于200μlBindingBuffer中,加入10μlAnnexinⅤ2FITC和5μlPI,轻轻混匀后避光4℃反应30min;最后加入300μlBindingBuffer用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。1.2.3U251细胞端粒酶活性的检测采用TRAP2验。P≤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1U251细胞增殖抑制率5、10、20、40、80μg/mlGS2Rh2组U251细胞增殖抑制率分别为20.42%、32.19%、45.09%、57.37%、73.82%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC30、IC50、IC70值分别为9.7、25.2、68.4μg/ml。2.2U251细胞凋亡情况FITC和PI荧光双参数点图显示对照组细胞主要分布在左下象限的活细胞区,实验组细胞分布区域出现明显改变,随着药物浓度的增加,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。2.3U251细胞端粒酶活性对照组和9.7、25.2、68.4μg/mlGS2Rh2组U251细胞培养0、12、24、48、72h端粒酶活性见表1。表1对照组和GS2Rh2组U251细胞培养不同时间端粒酶活性比较(-x±s)端粒酶活性(OD值)组别培养0h培养12h培养24h培养48h培养72h对照组1.7134±0.01041.7165±0.01681.7057±0.01321.7056±0.10831.7091±0.01239.7μg/mlGS2Rh2组1.7019±0.01121.7093±0.14361.6971±0.01131.5948±0.013130.9263±0.0969325.2μg/mlGS2Rh2组1.7131±0.00971.7072±0.14321.5991±0.012431.2072±0.014930.7934±0.0129368.4μg/mlGS2Rh2组1.7103±0.01311.6741±0.032431.4141±0.012930.9890±0.112730.6155±0.02583注:与对照组相比,3P0.052.4U251细胞hTERTmRNA浓度为25.2μg/mlGS2Rh2作用24、48、72h的U251细胞hTERTmR2NA与β2actin灰度值比为0.9649±0.0042、0.4018±0.0014、0.2978±0.0018,对照组为0.9764±