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人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌生物热活性的影响曹俊岭1，李宏1，范秀荣1，肖小河2，付鹏11北京中医药大学东直门医院药学部北京1007002解放军302医院全军中药研究所北京100063摘要目的：探讨人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌生物热活性的差异，为中药的活性筛选构建新的方法。方法：应用生物热动力学的方法，对人参皂苷Rg1、Rb1和Rd对生物模型的热活性的影响进行研究，计算总体发热量（Q），最高发热量（Pmax），最高发热时间(Tmax)代谢速率常数1（k1）和代谢速率常数2（k2）等热力学参数，应用主成分分析等统计方法对数据进行处理，并应用琼脂扩散法对各种皂苷的抑菌活性进行验证。结果人参皂苷Rg1、Rb1在小剂量时对大肠杆菌代谢产热有轻微的促进作用，但随着剂量的增加则作用下降且产生抑制作用,但二者没有明显的差别；人参皂苷Rd从小剂量时就可使Pmax降低，k2下降，并随着剂量的增加而增加（P0.01），且在同等剂量下，其降低Pmax、k2的作用明显强于人参皂苷Rg1、Rb1（P0.01），各种皂苷的常规抑菌活性与生物热活性结果基本一致。结论人参皂苷Rd对大肠杆菌的代谢产热有较强的抑制作用，人参皂苷Rg1、Rb1次之；同时为生物热动力学方法在药效物质筛选方面的应用提供依据。关键词人参皂苷Rg1、Rb1、Rd大肠杆菌生物热活性EffectsofBiothermo-activityof3GenosidesonEscherichiacoliCaoJuning,LiZulun,XiaoXiaohe1PharmacyDepartment,DongzhimenHospitalAffiliatetoBeijingUniversityofTCM(Beijing100700);2PLAInstituteofChineseMaterialMedica，302HospitalofPLA(Beijing100039);3CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTCM(Sichuan610071)Abstractobjective:Toinvestigatethedifferenceofbiothermo-activityof3genosidesonEscherichiacoliandestablishthemethodforactivityscreeningofChinesematerialmedica.Method:BiothermokineticswasusedtoexaminetheeffectsofdifferentgenosidesonEscherichiacoli.Thermodynamicsparameter,suchasQ,Pmax,Tmax,k1andk2werecalculated.Andtheywereanalysisbyprincipalcomponentanalysis.Result:Genosides-Rg1andRb1canpromotethemetabolicheatproductionofEscherichiacoliinlowdosages.Butwithincreasingofdosage,theheatproductionofEscherichiacoliisinhibited.TheheatproductionofEscherichiacoliisinhibitedbyGenosides-Rd.anditissuperiortogenosides-Rg1andRb1（P0.01）.Conclusions：Genosides-RdhasthebesteffectstoinhibittheheatproductionofEscherichiacoliandGinsengside-Rg1andRb1wereinferiortoit.Meanwhile,thislabalsoprovidetheevidencesfortheapplicationofthermokineticsonactivityscreeningofChinesematerialmedica..Keywords3genosides，Escherichiacoli，biothermo-activity生物热动力学方法实际上就是一种基于生物体生长代谢过程中能量转移和热变化测定的生物活性检测方法，也称生物热活性检测方法。多年来，在微生物代谢、组织细胞、中药物质基础筛选等多个方面已广泛应用[1-4]。随着仪器性能的不断提高，生物热分析技术在生命科学中也得到了长足的发展。人参为五加科植物人参的干燥根，主要由多种皂苷组成，现对其中的几种单体皂苷对大肠杆菌生物热活性的影响进行比较研究，为生物热力学方法在中药药国家自然科学基金项目(30500670)；国家重点基础研究发展计划(973计划)：2007CB512607效物质筛选中的应用提供依据。材料与方法1.实验仪器微量量热仪(瑞典TAMAir公司)2.实验试剂人参皂苷－Rg1（批号110703-200322）、－Rb1（批号110704-200318）对照品购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；人参皂苷－Rd购自成都思科华生物技术有限公司，供含量测定用，HPLC＞98％，将各样品配置成所需浓度，微孔滤膜滤过除菌，备用。3实验方法3.1培养基配置L.B培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，溶于1000mL蒸馏水中，调pH=7.2后分装，121℃高压蒸气灭菌20min，4℃冰箱中放置备用。3.2微量热检测无菌操作下将大肠杆菌接种于一定的液体培养基中，摇匀，向每个安瓿瓶中准确加入含1×106细菌的培养基溶液，然后加入不同浓度样品的无菌溶液，加盖瓶塞，密封后放入37℃恒温的微量量热仪中，用数据采集软件跟踪记录细菌生长过程热功率－时间曲线（P-t图），当曲线重新返回基线时，实验结束。据文献[5]计算总体发热量（Q），最高发热量（Pmax），最高发热时间(Tmax)代谢速率常数1（k1）和代谢速率常数2（k2）热力学参数。3.3采用琼脂扩散法，将高压灭菌后的固体琼脂培养基趁热倒入干燥灭菌的直径12cm培养皿内，冷凝后再倒入一层，每层厚度2mm，待培养基冷凝后，倒入0.3mL菌悬液均匀涂布平板，然后用无菌金属打孔器打出直径6mm，深2mm的小孔，用无菌针头小心除去孔内残留琼脂，吸取不同浓度药液约200μL加入孔内，每一种药液作３个平行，待药液全部渗入琼脂中，翻转平板，使培养基在上，置于恒温培养箱中37℃培养24h后，观察抑菌圈直径的大小。4统计学方法数据计算应用Originpro7.5；应用SAS8.0软件，对热力学参数进行主成分分析；组间比采用单因素方差分析。实验结果1微量热检测结果表1人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌代谢产热影响的热力学参数（n＝3）组别剂量（µg/mL）Q(J)Tmax(min)Pmax(µW)k1(10-2/min)k2(10-3/min)空白－63.27±0.97697.33±1.531805.33±16.921.29±0.037.16±0.14－Rg1564.96±1.55673.00±2.002057.33±4.041.25±0.017.36±0.211064.56±0.19669.00±3.002005.67±2.521.23±0.127.94±0.072066.43±0.39669.33±2.521789.00±3.001.23±0.116.84±0.204063.36±2.09710.67±4.511597.67±7.51*1.22±0.046.22±0.10*8063.17±0.07724.67±3.511460.33±5.51*1.24±0.045.97±0.06*－Rb1564.27±0.10665.33±1.532062.67±9.501.24±0.087.72±0.111063.39±0.82704.67±11.501644.67±47.521.27±0.046.84±0.092063.84±1.25707.00±6.001525.00±18.521.25±0.126.07±0.104063.28±0.96707.33±2.081458.67±25.50*1.25±0.025.36±0.31*8063.19±0.06712.00±9.001316.67±28.01*1.21±0.104.21±0.14*－Rd566.85±0.46714.33±17.501743.67±52.601.28±0.076.30±0.221066.86±0.61762.67±27.571683.33±30.01*1.25±0.125.87±0.28*2065.61±0.66745.00±17.521362.00±29.51*1.25±0.074.83±0.37*Δ4068.43±1.05696.67±5.51942.33±26.50*1.23±0.103.95±0.21*Δ8055.44±1.35700.67±5.51757.33±11.50*Δ1.22±0.102.13±0.09*Δ*与空白组比P0.01,Δ与Rg1和Rb1同剂量相比P0.01。为了判断影响生物热活性的主要因素，以人参不同单体皂苷对大肠杆菌生物热活性影响的热力学参数Q、Tmax、Pmax、k1、k2的作为因子X1、X2、X3、X4、X5，输入SAS统计软件，作主成分分析，分析结果表明在热力学参数中Pmax和k2为反映大肠杆菌代谢产热的主要指标，可基本表征对生物热活性的影响。因此主要针对Pmax、k2两个参数进行方差分析，由表1可知人参皂苷Rg1、Rb1在小剂量时均可使Pmax增加，k2加快，提示了以上几种单体皂苷对大肠杆菌代谢产热有轻微的促进作用，但随着剂量的增加则作用下降且产生抑制作用；人参皂苷Rd从小剂量时就可使Pmax降低，k2下降，并随着剂量的增加而增加（P0.01），且在同等剂量下，其降低Pmax、k2的作用明显强于人参皂苷Rg1、Rb1（P0.01），由此提示了人参皂苷Rd对大肠杆菌的代谢产热有较强的抑制作用。2体外抑菌活性实验结果从表2可以知，人参皂苷Rg1和Rb1在80µg/mL时才出现微弱的抑制作用；在同等剂量下，人参皂苷Rd抑菌环直径明显高于人参皂苷Rb1、Rg1（P0.01），人参皂苷Rd最强。这与3种人参皂苷单体影响大肠杆菌的生物热活性的结果基本吻合。表2人参皂苷Rg1、Rb1、Rd对大肠杆菌的常规抑菌活性结果（n=3,xs，）组别剂量（µg/mL）抑菌环直径（mm）－Rg150100200401.2±0.2802.4±0.3－Rb150.3±0.1100.6±0.2200.8±0.2401.3±0.2802.5±0.2－Rd50.7±0.1102.1±0.3﹡203.7±0.6△﹡405.9±0.8△﹡807.7±0.4△﹡与同剂量Rg1、Rb1对比，﹡P0.01；与同剂量Rg1、Rb1对比＃P0.05.“0”表示抑菌圈没有发生变化。讨论基于能量代谢的药效物质筛选是近年来逐渐在生命科学中应用的方法，新陈代谢包括物质代谢和能量代谢两个方面，二者密不可分。生物体内机械能、化学能、热能及光、电等能量的相互转变就是能量代谢，在这些过程中，有一部分能量不可避免地会以热的形式散发出来，这就是代谢热，并且这种能量的转移和热变化在一定的阈值范围内呈现规律性变化，生物热动力学就是在这个基础上建立起来的。另一方面，中药的生物活性实质上就是中药药效物质对生物体新陈代谢过程中能量代谢或/和物质代谢的干预作用，这种干预作用也不可避免地将影响生物体生长代谢的能量转移和产热变化，这种相互作用可能是物理反应，也可能是化学反应，而任何反应发生时，均伴随有能量的转移和变化（表现为吸热或放热）。此外，无论生物体新陈代谢伴随的能量转移和热变化还是化学反应伴随的能量转移和热变化，都可以用生物热动力学特别是量热学方法定性定量地测定，都可以用不同