人参皂苷Rg1和Rh1抗肿瘤作用的研究

人参皂苷Rg1和Rh1抗肿瘤作用的研究陈声武,王岩,王毅,王丽娟,何忠梅,王本祥(吉林天药科技股份有限公司天然药物研究所,吉林长春130012)[基金项目]国家自然科学基金资助课题(39570861)[作者简介]陈声武(1958-),男,吉林省长春市人,副主任医师,在读医学博士,主要从事中药吸收入血有效成分及其生物活性的研究。[摘要]目的:研究人参皂苷Rh1及其前体Rg1的整体及离体抗肿瘤作用。方法:整体实验4种小鼠移植性肿瘤:小鼠宫颈癌-14(U14)、艾氏腹水癌(EAC)、肉瘤-180(S180)和肝癌腹水型(HepA)腋部皮下接种,于接种10d内,每天给药1次,计算各给药组肿瘤抑制率。离体抗肿瘤实验用3种瘤株:A375-S2、T98G和HeLa。结果:人参皂苷Rg1(200mg·kg-1,灌胃)和Rh1(40和20mg·kg-1,腹腔注射)对U14均具有明显的抑制作用(P0.01);人参皂苷Rh1在较高剂量(40mg·kg-1)时,对EAC也有明显抑制作用(P0.01)。但人参皂苷Rg1和Rh1对S180和HepA无抗肿瘤作用。离体实验证明,Rg1对HeLa细胞的增殖有明显的抑制作用,Rh1高剂量组(100mg·L-1)对3种肿瘤细胞均有明显抑制作用。结论:人参皂苷Rh1较其前体Rg1具有更强的整体和离体抗肿瘤作用。[关键词]抗肿瘤药,植物;人参皂苷;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rh1;抗肿瘤作用[中图分类号]R961;R-332[文献标识码]A人参具有抗肿瘤作用已有许多报道[1-3]。近些年来,亦有人报道人参皂苷Rh1、Rh2和Rg3具有抗肿瘤作用[4-7]。本研究前期实验证明,给大鼠或人口服人参皂甙Rg1后,其在肠道内被肠内菌代谢成人参皂苷Rd、Rf1、Rh1和原人参三醇等代谢产物,人口服Rg1后其吸收入血的代谢产物为人参皂甙Rh1[8],因此对Rh1的药理作用,特别是对其抗肿瘤作用及其作用机制值得深入研究。本实验对前体人参皂苷Rg1和代谢物Rh1的抗肿瘤活性进行比较,以了解人参皂苷Rg1代谢前后活性的变化。1材料与方法1.1动物昆明种小鼠,雌性,18~22g,购自东北师范大学动物室。1.2试剂及药品人参皂苷Rg1和Rh1,由吉林大学天然药物研究室提供(纯度98%);注射用环磷酰胺(cytoxan,CTX),规格:200mg/支,批号:980101,上海华联制药有限公司产品。1.3细胞株离体抗肿瘤实验用以下3种瘤株:人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人子宫癌细胞(HeLa细胞)、人胎儿胶质细胞瘤细胞(T98G细胞)。上述细胞均购自美国ACTT。整体抗肿瘤实验用以下4种瘤株:S180、EAC、U14和HepA,均为小鼠腹水传代,购自天津医药科学研究所。1.4仪器CO2培养箱(美国Revco公司产品);TLL-C型台式高速冷冻离心机(北京四环科学仪器厂产品);Olympus生物显微镜;37XA8光学倒置显微镜(日本Olympus公司);M450型酶标仪(美国BIORAD公司)。1.5实验方法1.5.1整体抗肿瘤实验方法实验小鼠随机分为对照组(蒸馏水20ml·kg-1,灌胃)、CTX(30mg·kg-1,腹腔注射)、人参皂苷Rg1(200mg·kg-1,灌胃)、人参皂苷Rh1(40和20mg·kg-1,腹腔注射)5组。选取移植肿瘤7d,肿瘤生长良好,腹部膨隆明显的小鼠,腹部皮肤消毒,用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔,抽取腹水,放入无菌烧杯中,以生理盐水稀释成1:3(S180、EAC、U14)或1:2(HepA)的癌细胞混悬液,于每只实验小鼠右腋皮下接种0.2ml[4]。各组动物于接种肿瘤次日开始给药,每日1次,连续给药10d。当环磷酰胺组和Rh1组小鼠腹腔注射给药时,其它各组腹腔注射生理盐水10ml·kg-1,对照组和Rg1组灌胃所试药物时,其余各组灌胃生理盐水20ml·kg-1。给药结束次日,将动物称体重后拉断颈椎处死,剥离出皮下肿瘤组织称重,比较各组肿瘤生长情况。结果以x±s表示,组间比较采用t检验。1.5.2离体抗肿瘤实验方法用消化液消化肿瘤细胞,调整细胞密度至2×105个·ml-1,接种于96孔培养板中(100μl/孔),置CO2培养箱培养24h后,吸去孔内溶液,加入90μl培养液[RPMI1640培养液,加入5%小牛血清(NCS)及10μl样品(Rg1及Rh1浓度均为100、10、1mg·L-1],各组均设不加NCS的平行对照组。置培养箱中培养24h后,取出培养板,弃去上清液,用生理盐水100μl洗3次,加结晶紫10μl,10min后,用流水洗至水无色,用酶标仪测490nm处吸收值,以此表示肿瘤细胞浓度。2结果2.1人参皂苷Rg1和Rh1对实验性移植肿瘤重量的影响各组动物体重、肿瘤重量及抑瘤率统计结果见表1~4。2.2人参皂苷Rg1和Rh1对离体肿瘤细胞增殖的影响人参皂苷Rg1和Rh1对3种肿瘤细胞增殖的影响见表5。由表5可见,加入NCS的Rg1的高剂量组(100mg·L-1)对HeLa细胞的增殖有明显的抑制作用,在不加NCS组中,Rg1各剂量组均对HeLa细胞有抑制作用(P0.001)。不论NCS存在与否,Rh1高剂量组(100mg·L-1)对3种肿瘤细胞均有明显抑制作用。在NCS不存在时,Rh1中和低剂量组(10和1mg·L-1)对HeLa细胞有明显的抑制作用(P0.001)。3讨论实验证明,人和大鼠口服人参皂苷Rg1后,Rg1在肠道内要被肠内菌代谢成一系列代谢产物,在人体内代谢物Rh1是主要吸收入血的代谢物[8]。Park等[9]报道,人参皂苷Rh1和Rh2剂量为50mg·L-1时,对人纤维肉瘤细胞的增殖有明显抑制作用。本实验结果表明,人参皂苷Rg1(200mg·kg-1)和Rh1(40和20mg·kg-1)对小鼠U14均具有明显的抑制作用;人参皂苷Rh1在较高剂量(40mg·kg-1)时,对EAC有明显抑制作用;剂量较低时(20mg·kg-1)虽也有抑制趋势,但与对照组比较差异无显著性,说明前体人参皂苷Rg1与其吸收入血代谢物Rh1相比,Rh1具有较强的抗肿瘤作用,但Rg1和Rh1对小鼠S180和HepA均无明显抑制作用,表明其对肿瘤有选择性抑制作用。离体实验证明,Rh1在高浓度时,对A375,T98G和HeLa等肿瘤细胞的增殖有抑制作用,而Rg1仅对HeLa细胞有抑制作用。可见前体化合物Rg1分子中第3位碳上的糖被肠内菌酶解后,仅在第6位碳上有1个葡萄糖的代谢物Rh1的抗肿瘤谱增加和抗肿瘤作用增强。本研究室既往研究工作证明[10],Rg1和Rh1对THP-1细胞分泌TNF-α也有不同的影响,甚至作用完全相反,如在高浓度LPS(100mg·L-1)时,Rh1浓度为100、10、1mg·L-1时,对THP-1细胞分泌TNF-α有促进作用,且呈量效关系,但在此条件下,Rg1对TNF-α的产生则呈明显抑制作用。在低浓度LPS(10mg·L-1)时,Rh1浓度为1mg·L-1时,对TNF-α的分泌有非常明显的促进作用,而在此条件下,Rg1对TNF-α的分泌则无明显影响。RT-PCR实验证明[11],低浓度LPS和PMA200pmol·L-1时,Rh1对TNF-α蛋白质产生和基因表达有相关性。综上所述,人参皂苷Rh1无论在离体或整体条件下,均具有抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用可能与其促进TNF-α的分泌及其基因表达有关。Rh1为口服Rg1后吸收入血的代谢产物,两者在抗肿瘤方面(整体或离体)及对细胞因子TNF-α产生及其基因表达的影响均有明显区别。本研究结果为今后合理应用Rh1和Rg1,特别是合理应用给药途径提供了药理学基础。[参考文献][1]王本祥,徐东铭,段维和,等.人参研究[M].天津:天津科学技术出版社,1984.251-263.[2]王本祥,刘爱静,崔景朝.人参多糖抗肿瘤作用[J].人参研究,1991,(2):22-25.[3]OdashimaS,OhtaT,KohnoH,etal.ControlofphenotypicexpressionofculturedB16melanomacellsbyplantglycosides[J].CancerResearch,1985,45(6):2781-2784.[4]AzumaI,MochizukiM.Inhibitionoftumorcellinvasionandmetastasisbyginsenosids[J].TheGinsengReview,1994,(18):37-39.[5]TodeT,HirataJ,KitaT.etal.EffectsofginsenosideRh2andRg3ongrowthandinvasionofhumanavarianline(HRA)invitroandinvivo[J].TheGinsengReview,1994,(18):27-33.[6]LeeHY,KimSI,LeeSK.DifferentiationinducingactivityofginsenosidesinF9teratocarcinomastemcell[J].TheGinseng—27—陈声武等人参皂苷Rg1和Rh1抗肿瘤作用的研究mReview,1994,(20):77-83.[7]OdashimaS,HonjoN,NakayabuY,etal.Effectofginseno-sidesonculturedmorrishepatomacells(MH1C1).I.Pheno-typictransformationofhepatomacells[J].JKanazawaMed.Univ1978,1978,3(1):91-94.[8]王毅,刘铁汉,王巍,等.人参皂苷Rg1的肠内菌代谢及其代谢产物吸收入血的研究[J].药学学报,2000,35(4):284-288.[9]ParkMT,ChaHJ,JeongJW.etal.Anti-invasiveactivityofginsenosideRh1andRh2intheHT1080cells[J].GinsengRes,1998,22(3):216-219.[10]WangYi,WangBen-Xiang,LiuTie-Han,etal.StudiesonthemetabolismofginsenosideRg1byintestinalbacteriaⅡ.ImmunologicalactivityofginsenosideRh1andRh1[J].ActaPharmacolSin,2000,21(9):792-796.[11]YabeT,YamadaH.InductionmechanismofnervegrowthfactorsynthesisbyKami-nutan-to;RolofcyclicAMPandc-fosmRNAaccumulation[J].Phytomedicine,1997,4:191-198.StudyonAnti-TumorActivityofGinsenosideRg1andRh1CHENSheng-wu,WANGYan,WANGYi,WANGLi-juan,HEZhong-mei,WANGBen-xiang(JilinInstituteofNaturalMedicine,TianYaoScienceandTechnologyCo.,Ltd,Changchun130012,China)[Abstract]Objective:TostudytheeffectofginsenosideRh1andRg1ontheexperimentaltumorstrainsinvivoandinvitro.Methods:Carcinomaofuterinecervix(U14),Ehrlichascitescarcinoma(EAC),sarco-ma-180(S180)andhepaticcarcinomaofascitictype(HepA)wereusedforanti-tum