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第九章葡萄糖氧化酶（GOD）GlucoseOxidase，简称GOD，β-D-葡萄糖：氧氧化还原酶；EC1.1.3.4）是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸内酯。•1928年由Muller首先从黑曲霉（Aspergillusniger）的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。随后有人分别从青霉（P.Variable）和黑曲霉中提纯葡萄糖氧化酶。•其他霉菌，象米曲霉和点青霉也能产生葡萄糖氧化酶，然而在高等植物和动物体内还没有发现葡萄糖氧化酶。一、葡萄糖氧化酶催化的反应•葡萄糖氧化酶的催化反应，按条件不同有如下三种形式：–在没有过氧化氢酶存在下，每分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1分子氧。C6H12O6+O2+H2O→C6H12O7+H2O2•在有过氧化氢酶存在下，每分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1原子氧。C6H12O6+1/2O2→C6H12O7•在有乙醇和过氧化氢酶存在下，过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用，此时，每分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1分子氧。C6H12O6+C2H5OH+O2→C6H12O7+CH3CHO+H2O二、葡萄糖氧化酶的催化特异性•葡萄糖氧化酶对β-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。葡萄糖氧化酶底物分子C1上的羟基在酶的催化作用中起到重要作用，且羟基处在β-位时酶的活力比处在α-位时高约160倍。底物分子中的任何一点改变都会显著降低其氧化速率。OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHHδ-D-葡萄糖酸内酯D-葡萄糖酸葡萄糖氧化酶的底物特异性葡萄糖改性的位置化合物同β-D-葡萄糖的差别相对酶活β-D-葡萄糖1001α-D-葡萄糖C1上OH的构型0.6411,5-脱水-D-葡萄糖醇C1上OH被H取代022-脱氧-D-葡萄糖C2上OH被H取代3.32D-甘露糖C2上OH的构型0.9822-O-甲基-D-葡萄糖C2上OH的H被甲基取代033-脱氧-D-葡萄糖C3上OH被H取代14D-半乳糖C4上OH的构型0.544-脱氧-D-葡萄糖C4上OH被H取代255-脱氧-D-葡萄糖C5上OH被H取代0.055L-葡萄糖C5上CH2OH的构型066-脱氧-D-葡萄糖C6上OH被H取代06木糖C6被H取代0.98三、葡萄糖氧化酶的分子组成及其作用机制•葡萄糖氧化酶以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基，来源不同，其分子量亦有所差别。•目前葡萄糖氧化酶的工业酶制剂主要来源于黑曲霉，因此黑曲霉葡萄糖氧化酶是这类酶中研究得最为彻底的一种。黑曲霉葡萄糖氧化酶分子量为160000左右。•实验数据证明，葡萄糖氧化酶催化的反应的速度同时取决于O2和葡萄糖的浓度，反应遵循乒乓机理，可以用下面的图表来表示：•图中G和L分别代表β-D-葡萄糖和δ-D-葡萄糖酸内酯。也可以用下式描述葡萄糖氧化酶催化的反应：OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHHδ-D-葡萄糖酸内酯D-葡萄糖酸•反应中，氧化态酶EFAD作为脱氢酶从β-D-葡萄糖分子中取走两个氢原子形成还原态酶EFADH2和δ-D-葡萄糖酸内酯，随后δ-D-葡萄糖酸内酯非酶水解成D-葡萄糖酸，同时还原态葡萄糖氧化酶被分子氧再氧化成氧化态葡萄糖氧化酶。如果反应体系中存在过氧化氢酶，那么H2O2被催化分解成H2O和O2。四、温度对葡萄糖氧化酶作用的影响•葡萄糖氧化酶催化反应需要氧的参与，反应温度改变将导致反应体系中氧的浓度发生改变，从而影响酶活性。温度升高时，反应体系中氧的溶解度下降，这就抵消了温度升高对酶反应速度的影响。•①葡萄糖氧化酶催化的反应具有较低的Q10；•②在一定温度范围内（30～60℃），温度变化对葡萄糖氧化酶活力的影响不显著。五、pH对葡萄糖氧化酶作用的影响•葡萄糖氧化酶的活性在pH4.5～pH7.0之间保持良好的稳定性。pH大于7.0或小于4.5酶将迅速失活。•酶的底物起着稳定酶的作用，例如，在pH8.1和不存在葡萄糖的条件下，10分钟内酶活力损失90%；而在相同pH和存在葡萄糖的条件下，40分钟内酶活力仅损失20%。•在实际工作中的特定环境下，低pH时也可以使用葡萄糖氧化酶。例如，30℃时的霉菌葡萄糖氧化酶制剂在pH2.6条件下的可乐饮料和pH3.2的葡萄饮料中仍具有较高的稳定性。尽管在该环境下葡萄糖氧化酶的反应速度较慢，但它仍能起到催化作用。六、葡萄糖氧化酶的抑制剂•葡萄糖氧化酶的抑制剂为Hg2+、Ag+、对氯代汞基苯甲酸、苯基脲乙酯及肼、苯肼、亚硫酸钠、双甲酮等巯基螯合剂。腺嘌呤二核苷酸（FAD）对其结构有稳定作用。•甘露糖、果糖以及D-阿拉伯糖对葡萄糖氧化酶有比较明显的竞争性抑制作用，因此不宜与其共同使用。•氰化物和一氧化碳对酶没有抑制作用。七、葡萄糖氧化酶测定原理•氧存在情况下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化反应，形成D-葡萄糖酸，反应时吸收了氧，释放出过氧化氢，加过氧化氢酶后分解过氧化氢，产生的氧又将邻联二茴香胺氧化，变成一种棕色物质，在436nm下有最大吸收，与酶活性成正比。根据吸光度和标准值可计算出酶的活力。八、葡萄糖氧化酶在食品加工中的应用•葡萄糖氧化酶的作用归纳起来不外乎四个方面：一是去葡萄糖，二是脱氧，三是杀菌，四是测定葡萄糖含量。1、蛋类食品的脱糖保鲜•葡萄糖氧化酶最重要的应用之一就是防止美拉德反应。•由于蛋清中含有0.5%～0.6%的葡萄糖，因此在蛋类制品加工和贮藏过程中，极易发生葡萄糖分子中的羰基与蛋白质分子的氨基结合生成黑蛋白的美拉德反应。•美拉德反应不但导致食品中葡萄糖和游离氨基消失，还会使食品褐变、营养损失，风味也会发生变化，甚至产生有毒物质。因此，在蛋制品加工过程中往往要先进行蛋清的脱糖处理，以防止食品因氧化而引起的品质下降和变质。•早期在蛋制品工艺中多是采用干或湿酵母发酵的方法除去葡萄糖，该方法的缺点是周期长，卫生条件差，产品质量也不理想。近几年来，在干制蛋品加工中已普遍采用葡萄糖氧化酶进行脱糖处理。•用葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶体系将还原糖分子上的醛基转变成羧基，这样就消除了美拉德反应中的产物之一——还原糖。反应中需要不断地供给氧气，因此使用葡萄糖氧化酶脱糖时应分次加入适量的H2O2溶液，这样同葡萄糖氧化酶一起使用的过氧化氢酶就能分解H2O2，以补充反应所需要的氧。•另外，适当降低反应温度可以保持乳状液的稳定性，且由于温度降低后氧在蛋品中的溶解度提高，酶反应速度不受影响。因此，目前食品工业优先选择在低温下完成蛋品的脱糖操作。•采用葡萄糖氧化酶脱糖后的蛋制品基本上不会发生褐变。另外，脱糖处理后蛋清可保持原有色泽，且蛋腥味消失，起泡性和起泡稳定性均有明显提高，凝胶强度也有所增加。优良的起泡性和高凝胶性是蛋清的重要功能性质，在食品工业上有广泛应用，因此葡萄糖氧化酶脱糖法还有助于提高产品的实用价值。因此相对于其他脱糖方法而言，这也是葡萄糖氧化酶法脱糖的优点之一。2、防止食品氧化•食品在运输贮藏保存过程中，由于氧的作用，容易发生一系列不利于产品质量的化学反应，引起色、香、味的改变。•例如，氧的存在容易引起花生、奶粉、饼干、油炸食品等富含油脂的食品发生氧化作用，引起油脂酸败，产生不良风味而造成食品营养损失、变质。•氧化也会引起去皮果蔬、果酱以及肉类发生褐变。•另外氧的存在也为许多微生物生长创造了条件，导致食品风味品质下降。•解决氧化问题的根本办法是脱氧。•葡萄糖氧化酶是一种理想的除氧保鲜剂，可有效防止食品因氧化而引起的质量下降和变质。•罐藏食品可以使用含葡萄糖氧化酶的吸氧保鲜袋防止氧化，罐装果汁、酒和水果罐头等可以直接加入葡萄糖氧化酶以保持品质，另外葡萄糖氧化酶也可以有效地防止罐装容器的氧化作用。•脱氧方法具体应用如下：（1）干鲜食品脱氧瓶装或罐装的干鲜食品贮藏时，因容器密封性差，所以有必要除去氧。可以在容器中放入含葡萄糖氧化酶及其作用底物葡萄糖的吸氧保鲜袋，这样容器中的氧气透过薄膜进入袋中就在葡萄糖氧化酶作用下与葡萄糖反应，从而达到脱氧的目的。（2）酒类脱氧啤酒中含氧过高易引起啤酒的氧化，产生老化味，严重影响啤酒质量。利用葡萄糖氧化酶复合体系，可以有效地去除啤酒中的溶氧，在啤酒加工过程中以及包装后的贮藏中起到保护作用。•葡萄糖氧化酶用于啤酒脱氧时的使用量为每升啤酒中加10～70个单位，添加时机以发酵后啤酒与酵母刚刚分离时较为理想。•但是，尽管利用葡萄糖氧化酶可以有效地去除溶氧，啤酒风味的稳定性并没有得到很好的改善，因此近几年来葡萄糖氧化酶在啤酒脱氧方面应用的研究进展不大。–氧的存在给白葡萄酒的生产造成极大的困难，葡萄皮、葡萄梗和葡萄籽中含有较高的多酚氧化酶和酚类物质，会使白葡萄酒发生褐变，尤其是使用原料的成熟度较差或以霉变的葡萄为原料酿制白葡萄酒，问题更为严重。–如在生产过程中添加浓度为20～40单位/L酒的葡萄糖氧化酶，便可以有效地减轻氧造成的危害。–另外，当葡萄糖氧化酶应用于葡萄酒脱氧时，添加适量的葡萄糖可在一定程度上加快氧气消除的速度。–白葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶能够防止葡萄酒发生酶褐变和口感、味觉的变化，还可以防止色素的沉淀，延长保存期。（3）饮料脱氧保鲜果汁在深加工过程中若发生氧化作用，其中的一些不饱和成分如不饱合脂肪酸和烯二醇类物质将会分解，使果汁品质低下。尤其是Vc等维生素类的物质的氧化会使营养大量流失。添加葡萄糖1g/L，葡萄糖氧化酶20mg/L即可有效防止氧化的发生。–含有果汁或天然油的所有柑橘类软饮料风味物质都容易逸失，光照后还会产生日光臭，降低饮料的品质和货架期。采用葡萄糖氧化酶除氧剂可以保持柑橘饮料的新鲜色泽风味。–该方法对于无果汁饮料也同样有效，实验证明葡萄糖氧化酶在软饮料中起到保持正常口味、防止饮料氧化褪色、除残氧后降低饮料中氧化的铁质等作用。（4）虾肉食品保鲜由于虾类固有的生物和生物化学特性（含水77%，蛋白质20.6%），使得其在加工储藏、运输、及销售过程中很容易腐败变质，严重影响它的经济价值和营养价值。传统的新鲜虾类保鲜方法是采用低温保存，但由于虾类自身存在的多酚氧化酶在虾类冷冻、冰藏和解冻期间仍然保持着活性，致使虾类食品都难以避免地发生褐变，因此对虾类保鲜来说防褐变是非常重要的。–如果将虾肉置于葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶溶液中浸泡，或将酶液加入到包装的盐水中，就能有效阻滞虾肉颜色的改变和防止蛤败的产生。采用葡萄糖氧化酶保鲜的虾肉食品，冷藏、冻藏都能保持二级鲜度，色泽、气味和弹性保持良好。葡萄糖氧化酶在虾、蟹肉等食品保鲜方面的应用有很好的发展前途。（5）稳定食品乳状液的质量油水乳化后的食品乳状液如蛋黄酱，由于在加工过程中引入了约占总体积10～20%的空气，尽管在控制金属离子污染上作了很大的努力，并且使用了螯合剂，然而货架寿命仍然因为受包藏的氧的作用而显著缩短。保藏期间的质量下降主要表现为颜色减褪和蛤败，并失去乳化性。在包装蛋黄酱的密闭容器中适量添加葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶体系以防止其在贮藏期间的变质，在之后6个月的保藏期内，通过感官评定和测定过氧化值来比较经处理的蛋黄酱和对照试样的质量稳定性，可以得出以下的结论：酶处理的效果显著，而且酶催化反应中生成的葡萄糖酸对于蛋黄酱的风味没有不良的影响。葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶处理对蛋黄酱稳定性的影响保藏期（月）感官评定颜色氧化值（mmol/kg样品）对照酶处理对照酶处理对照酶处理0++++0.20.22++++3-+++6.20.24-+-+5-+-+60+0+14.60.8（6）防止马口铁罐壁氧化腐蚀罐头生产虽然采用抽真空封罐，但罐头顶隙仍有氧气残留，特别是酸性介质，会腐蚀罐壁，形成氧化圈，影响罐内食品的风味。在罐头中应用葡萄糖氧化酶，可以减轻和防止氧化圈和罐内的溶锡。在罐装啤酒的情况下，也能减少马口铁罐壁的氧化腐蚀和铁锡等重金属离子的溶出，保持其原有风味。3、杀菌•由于葡萄糖氧化酶能去除氧，所以能防止好气菌的生长繁殖；同时由于产生过氧化氢，也可起到杀