Alltech-2000型蒸发光散射检测器解决HPLC检测难题

ELSD检测器的选择和主要的应用介绍GRACE格雷斯公司探索科技~Davison从分析到制备的解决方案美国奥泰公司(Alltech)于2004年8月并入Grace公司，隶属于三大分支之一的Davison旗下的探索科技部门。Davison是全球最大的硅胶生产商，能够为LC,GC和LC的应用提供从小规模研发到大规模工业生产的一站式解决方案。HPLC和GC柱，配件和仪器硅胶基色谱填料HPLC毛细柱和微径柱HPLC柱和小型仪器制备级和工业级LC柱和装柱服务生物分离专用HPLC柱和填料GRACE大纲常规检测器的回顾ELSD的检测原理ELSD与常规检测器的比较ELSD在分析上的优点AlltechELSD的介绍ELSD的维护质量保证总结GRACE其它检测器的介绍-紫外可见UV/Vis-示差折光RI-荧光Fluorescence-质谱MassSpectrometryGRACE检测器是高效液相色谱（HPLC）的核心部件之一，被喻为HPLC的眼睛。它的作用是将色谱柱流出物中样品含量的变化转换为可供观测的信号，通常是转换为电信号，以便自动记录下来进行定性定量分析。检测器的应用分布紫外可见65%示差和蒸发光10%电化学10%荧光8%质谱4%其它3%GRACE紫外/可见检测器UV/VIS优点：•易于操作•可靠性•费用相对低廉•溶剂梯度兼容•对样品没有破坏性•相对灵敏度高GRACE局限性：•没有好的发光基团的化合物响应较差•溶剂的使用上受紫外截止波长的限制荧光检测器Fluorescence优点：•很好的灵敏度•很好的选择性•受流速和温度的变化影响很小GRACE局限性：•线性范围窄•操作复杂-需要对化合物和仪器的变化了解透彻•某些物质如氧气会熄灭荧光-必须严格脱气•能够自然产生荧光的化合物不是很多•衍生方法复杂示差折光检测器RI优点：•通用性-对几乎所有的物质具有相应•宽的动态线性范围--104•易于操作GRACE局限性:•检测灵敏度不高•对于温度和压力的波动敏感•平衡慢•检测既有正峰也有负峰•不能进行梯度洗脱•流动相预先混合后的效果好于泵在线混合的质谱MS优点:•灵敏度高•选择性好•提供化学结构信息GRACE局限性:•购买费用高•操作复杂•需要经常维护•定量分析困难蒸发光散射检测器ELSD•发展历史•检测原理•局限性•优点•在分析中的应用GRACE发展历史:•第一台商业化的产品出现在80年代初期•最早的应用集中在聚合物的分析上•90年代初期，更多其它方面的应用•目前,应用在广泛的领域GRACEELSD行业超过20年的领先制造经验:GRACE500型2000型800型2000ES型3300型独特的检测方法：检测三部曲:雾化溶剂的蒸发检测GRACEELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测，而与被检测物质的化学基团关系不大，物理性质类似的物质响应一致，响应值与样品的质量成正比。第一步：雾化色谱柱流出物通过喷雾器针孔与氮气混合形成均匀的雾状液滴(气溶胶)GRACE第二步：溶剂的蒸发液滴通过加热的漂移管流动相蒸发干燥的样品颗粒保留GRACE第三步：检测样品颗粒通过流动池激光“撞击”颗粒被散射光电二极管检测散射光检测角度为90℃，避免虚假信号(90℃折射/衍射光；90℃反射光)GRACE两种类型气溶胶处理方式：A型-所有液滴进入漂移管及流动池(又称为“无气溶胶分流NoAerosolSplitting”)B型-部分液滴分流排掉；只有一部分进入漂移管及流动池(“气溶胶分流AerosolSplitting”)GRACEA型ELSD-气溶胶不分流操作所有样品从喷雾器进入漂移管及流动池需要较高温度才能完全蒸发流动相；A型ELSD只有不分流一种操作模式GRACEB型ELSD-气溶胶分流操作部分样品被排掉较低的温度已足够蒸发所有溶剂B型ELSD只有分流一种操作模式GRACEAlltech2000(ES)型ELSD唯一提供两种操作模式的ELSD，在任何流动相及样品分析条件下均达到最佳结果GRACE一台仪器，两种操作模式：撞击器(Impactor)关-所有液滴进入漂移管及流动池(A型ELSD-无分流)撞击器(Impactor)开-部分液滴被排除，只有一部分进入漂移管及流动池(B型ELSD-气溶胶分流)采用新型专利“气溶胶分流技术”USPatent#6229605GRACE撞击器关模式撞击器与气溶胶流向平行所有样品流过漂移管到达流通池最适用于非挥发性样品及挥发性溶剂(大部分为有机)DriveShaftNebulizerOpticsImpactor‘Off’GRACENebulizerDriveShaftImpactor‘Off’OpticsExhaustDriftTubeNebulizerImpactorDrain撞击器开模式撞击器垂直于气溶胶流向，部分液滴碰上撞击器从废液管排掉;其余穿过撞击器，经过漂移管到达流动池最适用于半挥发性样品及低挥发性溶剂(大部分为水溶液)DriveShaftNebulizerImpactor‘On’OpticsGRACENebulizerDriveShaftImpactor‘On’NebulizerDrainImpactorDriftTubeExhaustOptics撞击器关-最适合非挥发性样品Column:Alltech700CHCarbohydrateColumn10µm,300x6.5mmMobilePhase:100%WaterFlowrate:0.5mL/min1.蜜三糖(50µg/mL)2.乳糖(50µg/mL)3.葡萄糖(50µg/mL)4.甘露糖(50µg/mL)Column:Alltech700CHCarbohydrateColumn10µm,300x6.5mmMobilePhase:100%WaterFlowrate:0.5mL/min#9206#9205Impactor‘On’Impactor‘Off’碳水化合物非挥发性样品在撞击器“关”的情况下也不挥发，全部进入流动池，得到最高灵敏度GRACE撞击器关-最适合挥发性溶剂有机溶剂在较低温度蒸发，在撞击器“关”的情况下，也会完全蒸发，B型ELSD任何条件下均分流，造成样品损失，降低检测灵敏度Column:AlltechEconosphere®,C18,5µm,150x4.6mmMobilePhase:Methanol:Water(90:10)Flowrate:0.8mL/minColumn:AlltechEconosphere®,C18,5µm,150x4.6mmMobilePhase:Methanol:Water(90:10)Flowrate:0.8mL/min1.n-癸基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)2.n-辛基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)3.n-十二烷基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)葡萄糖苷分析Impactor‘On’Impactor‘Off’#9180#9179GRACE撞击器开-最适合半挥发性样品在撞击器开情况下，可以较低温蒸发溶剂，防止半挥发性样品蒸发防腐剂分析Column:AlltechEconosphere®,C18,5µm,150x4.6mmMobilePhase:Methanol:Water(90:10)Flowrate:0.8mL/minColumn:AlltechEconosphere®,C18,5µm,150x4.6mmMobilePhase:Methanol:Water(90:10)Flowrate:0.8mL/min1.羟基苯甲酸甲酯2.羟基苯甲酸乙酯3.羟基苯甲酸丙酯4.羟基苯甲酸丁酯#9202Impactor‘Off’Impactor‘On’#9201GRACE撞击器开-在几乎室温下检测半挥发样品Column:Prevail™CarbohydrateES,5µm,250x4.6mmMobilePhase:Acetonitrile:0.04%AmmoniumHydroxide(80:20)Flowrate:1.0mL/min1.Glycerol甘油GRACEELSD的局限性1.只能使用挥发性的流动相2.样品的挥发性必须要小于流动相3.检测器响应是非线性的GRACE挥发性的流动相改性剂#1VolatileMobilePhaseModifierspKapKbpHRangeBPMPAcidsTrifluoroaceticAcid三氟乙酸0.313.7072.4°CFormicAcid甲酸3.7510.25100.7°CAceticAcid醋酸4.759.25116.0°CCarbonicAcid碳酸6.377.63—BasesAmmonia氨水9.254.75-33.35°CMethylamine甲胺10.813.1916.6°CEthylamine二乙胺10.663.34-6.3°CTriethylamine三乙胺11.012.9989.3°CBuffersAmmoniumFormate甲酸胺3.0-5.0120°CPyridiniumFormate甲酸吡啶翁3.0-5.0AmmoniumAcetate乙酸胺3.8-5.8111°CPyridiniumAcetate乙酸吡啶翁4.0-6.0AmmoniumCarbonate(forreversephase)碳酸胺(用于反相)8.0(adjusted)AmmoniumCarbonate碳酸胺5.5-7.5and9.3-11.3GRACE挥发性的流动相改性剂#2VolatileMobilePhaseModifierspKapKbpHRangeBPMPIon-PairReagentsPentafluoropropionicAcid五氟丙酸~0.696-97°CHeptafluorobutyricAcid七氟丁酸~0.6120°CNonafluoropentanoicAcid九氟戊酸140°CPentadecafluoroocatanoicAcid十五氟辛酸~0.6189°CTridecafluoroheptanoicAcid十三氟庚酸~0.6175°CGRACE载气流速与漂移管温度GRACE载气流速和漂移管温度是ELSD中可以调节的两个重要参数，建立适当的HPLC-ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化。优化的原则是降低噪声到可以接受的程度，并尽量提高信噪比。载气流速与漂移管温度GRACE漂移管温度对基线水平和噪音的影响并无明显的规律性。低于某一温度，基线水平较高，因为低于这一温度，流动相得不到充分挥发，而盐的加入将会提高这一温度，因为盐的挥发需要更高的温度，但并不是漂移管温度越高越好，因为温度太高会使流动相沸腾，反而会增加背景噪音，同时还有可能导致溶质的部分挥发，降低信噪比。故最优温度应为在流动相（包括其中所含的盐）基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度载气流速与漂移管温度GRACE一般来说，在其它条件不变的情况下，载气流速越小，形成的物质粒子半径越大，对激光的散射能力越强，相应的响应信号越大。但并不是载气流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相不能完全挥发，背景噪音会增加，信噪比也会降低。最优载气流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值时的最低流速。如何应对非线性响应的检测器？-选择2阶方程或者幂指曲线方程-使用曲线的仅仅线性部分-使用log/log双对数方法产生线性曲线即:对照品的浓度和面积同时取对数,至少两个点得到直线方程在中国药典2005版中，中药计算采用两点双对数方法,抗生素计算采用三点双对数方法GRACE散射光的响应值与粒子质量的关系：I＝kmb取对数：lgI＝blgm＋lgkm：待测组分的粒子质量和I：待测组分所产生的散射光光强k,b：常数Log-Log线性方程GRACECalibrationCurvesofMonoandDi-Glycerides0.0200.0400.0600.0800.01000.01200.01400.01600.01800.000.0050.