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细胞凋亡及凋亡检测2011-2-25一、概述•细胞凋亡(apoptosis)：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡）•1972年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样研究简史•半个世纪前:人们就观察到生理自发退化死亡现象.•1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程•1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念•1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。•1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等•1989年:0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。•1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因19701975198019851990199520002005020004000600080001000012000Thirtyyearsonapoptosispublications细胞死亡的形式•坏死：活体组织细胞的死亡•凋亡细胞凋亡与坏死的比较坏死凋亡性质诱导因素生化特点形态变化DNA电泳炎症反应凋亡小体基因调控病理性、非特异性强烈刺激，随机发生被动过程，无新蛋白合成细胞肿胀、细胞结构全面溶解、破坏弥散性降解，电泳呈均一DNA片状溶酶体破裂，局部炎症反应无无生理性或病理性，特异性较弱刺激，非随机发生主动过程，有新蛋白合成胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩DNA片段化（180-200bp）电泳呈梯状条带溶酶体相对完整，局部无炎反应有有坏死坏死炎细胞浸润凋亡细胞凋亡的生理病理意义•①确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）•②维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞•③发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制二、细胞凋亡的过程•细胞凋亡的大致过程：–凋亡信号转导–凋亡基因激活–细胞凋亡的执行–凋亡细胞的清除凋亡的四个阶段：凋亡诱导因素+受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡基因激活DNase激活Caspase激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞凋亡过程Ⅰ受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+DNase激活Caspases激活死亡信号凋亡过程ⅡDNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行三、凋亡时细胞的主要变化（一）细胞凋亡的形态学改变细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体，被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。空泡化固缩出芽边集凋亡小体形态学特征染色质边集嗜酸性小体(凋亡)嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小，胞浆浓缩红染，呈嗜酸性变；或胞浆进一步浓缩，细胞变圆，核碎裂，呈嗜酸性小体状（二）细胞凋亡的生化改变1.DNA片段化：形成180-200bp或整数倍的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状”条带，是判断凋亡发生的客观指标之一。凋亡后DNALadder的agarose电泳检测2.内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性核酸内切酶在核小体连接部切断DNA双链。•凋亡诱导因素→细胞内信号转导•无活性内源性核酸内切酶活性内源性核酸内切酶•→核小体连接部切断DNA双链→电泳呈特征性的“梯状”条带Ca++Mg++激活Zn++抑制3.Caspase的激活及其作用•Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶•主要作用：①灭活细胞凋亡抑制物（Bcl-2）②水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体③水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失某种生物学功能Caspase的作用目前被鉴定的哺乳动物CaspaseCaspase的特点1.含有高度保守的QACXG(X为R、Q或G）五肽序列；2.以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团；3.以天门冬氨酸为特异性底物（羧基端肽键断裂）；4.通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列激活；5.活化后水解底物，通过级联放大诱发凋亡；6.抑制剂，防止caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成伤害；3.Caspase触发凋亡途径•细胞外途径：细胞表面死亡受体途径•细胞内途径：线粒体引发途径•内质网介导的凋亡通路细胞外途径•细胞死亡信号蛋白结合细胞表面相应受体，死亡受体与配体结合，导致死亡结构域聚集，使死亡受体分子活化；•Caspase-8活化：Caspase酶原在局部聚集，FADD与procaspase-8的DED结合形成信号复合物，procaspase-8水解活化形成有活性的caspase-8；•细胞凋亡：激活的caspase-8激活下游的caspase引起细胞凋亡细胞内途径•是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径；•过程：凋亡刺激——死亡促进因子，包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白、Caspase酶原释放——Caspase活化——细胞凋亡内质网介导的凋亡通路•内质网钙离子内环境紊乱及过量内质网蛋白积累激活Caspase-12；•同时胞质中的Caspase-7移入内质网，进一步激活Caspase-12；•激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，细胞凋亡（三）细胞凋亡的调控1.细胞凋亡的相关因素（1）诱导性因素激素和生长因子失衡：缺乏（IL-2↓，淋巴细胞凋亡）或过多（糖皮质激素↑，淋巴细胞凋亡）理化因素：射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等免疫性因素：如，CTL分泌粒酶→靶细胞凋亡微生物因素：细菌、病毒及毒素。（HIV）（2）抑制性因素★细胞因子：IL-2、神经营养因子★激素：ACTH、睾丸酮、雌激素等★二价金属阳离子：Zn2+★药物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸★病毒：EB病毒、牛痘病毒CrmA2.细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点：①多样性：不同种类细胞有不同系统②耦联性：凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖③同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统④多途性：同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统：依据：①细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升②用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平，B淋巴细胞凋亡③用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平，阻止细胞凋亡激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+↑活化核转录因子1．胞内Ca2+信号系统（Ca2+为第二信使）2．cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使）依据：①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡②糖皮质激素使cAMP上升cAMP↑→激活PKA→使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化→改变蛋白质功能3．Fas蛋白/Fas配体信号系统Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→细胞凋亡机制：①Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）→神经鞘磷脂酶活性↑→产生神经酰胺→蛋白激酶激活→细胞凋亡②Fas蛋白+抗Fas、TNF→激活ICE样caspase→降解H1组蛋白→染色体松驰→DNA暴露内切酶位点③通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡4．神经酰胺信号系统神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-α、Fas抗原、糖皮质激素5．二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信号系统二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。依据：①活化的PKCβ1可诱导u937白血病细胞凋亡②抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡③PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡（糖皮质激素、T细胞受体激活、IL-2撤除）6．酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子→激活酪氨酸蛋白激酶→靶蛋白酪氨酸磷酸化→Ras蛋白激活→通过Raf-1、MAPKK、MAPK→蛋白质磷酸化→细胞分化生长因子或细胞因子撤除→不能激活酪氨酸蛋白激酶系统→细胞凋亡3.凋亡相关基因抑制凋亡基因：Bcl-2促进凋亡基因：P53、Bax、ICE双向调节基因：c-myc、Bclx(B细胞淋巴瘤/白血病-2[Bcelllymphoma/leukemia-2]基因的缩写)Bcl-2蛋白：229个氨基酸（人）、236个氨基酸（小鼠）分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用：Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据：①导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡②淋巴细胞有20%呈Bcl-2阳性时，预后不佳（耐受放射线、抗癌药物）（1）Bcl-2①直接的抗氧化作用②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质（细胞色素C、AIF）③抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用④抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活⑤维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制：作用：野生型（wtP53）：DNA结合蛋白，诱导细胞凋亡（“分子警察”）突变型（mtP53）：抑制细胞凋亡野生型P53的作用机制：P53蛋白→细胞周期G1期检查染色体DNA损伤（检查点功能）→发现DNA损伤→剌激CIP的表达→阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制→修复失败→启动细胞凋亡机制→细胞凋亡（2）P53c-myc:一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖，也可激活介导细胞凋亡，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子→增殖，无生长因子→凋亡）。Bcl-x：能翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（3）c-myc,Bcl-x三、细胞凋亡的发生机制1、氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：①各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡③抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（TNF-а、电离辐射）引起的细胞凋亡①引起DNA损伤，激活P53基因②引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭辅酶Ⅰ(NAD)，消耗大量ATP③攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸④激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶⑤细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变⑥活化核转录因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：2.钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：①各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程②凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）③钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）①激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链②激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成③激活核转录因子，加速凋亡相关