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分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异,首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起,就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后,分子标记技术日趋成熟,现已出现的分子标记技术有几十种,部分分子标记技术所属类型如下。2.1建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1)RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2)CISH(ChromosomeInSituHybridization)染色体原位杂交。2.2以重复序列为基础的分子标记技术(1)(SatelliteDNA)卫星DNA；(2)(MinisatelliteDNA)小卫星DNA;(3)SSR(SimpleSequenceRepeat)简单序列重复,即微卫星DNA。2.3以PCR为基础的分子标记技术(1)RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)随机扩增多态性DNA；(2)AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)扩增片段长度多态性；(3)SSCP(SingleStrandConformationPolymorphism)单链构象多态性；(4)cDNA-AFLP(cDNA-AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)cDNA-扩增片段长度多态性；(5)TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism)靶位区域扩增多态性；(6)SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)序列特征化扩增区域；(7)SRAP(SequencerelatedAmplifiedPolymorphism)相关序列扩增多态性。2.4以mRNA为基础的分子标记技术(1)ESTs(ExpressedSequenceTags)表达序列标签；(2)DD(DifferentialDislay)差异显示；(3)RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)逆转录PCR；(4)DDRT-PCR(DifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR)差异显示逆转录PCR；(5)RAD(RepresentativeDifferenceAnalysis)特征性差异分析；(6)SAGE(Serialanalysisofgeneexpression)基因表达系列分析。2.5以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术SNP(SingleNucleotidePolymorphism)单核苷酸多态性标记。2.6以特定序列为核心的分子标记技术mtDNA(MitochondrialDNA)线粒体DNA分子标记。3.代表性分子标记技术3.1RFLP限制性片段长度多态性RFLP(RestrictionFragmentLengthPoly�morphism)作为最早的分子标记技术由Grozdicker创立,并于1980年由Bostein再次提出[3]。其原理是限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点,如果因碱基的突变、插入或缺失,或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA,就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段,通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交,放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。RFLP分析中所使用的探针通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。其中cDNA探针保守性较强,许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。RFLP标记技术的优点是:(1)标记广泛存在于生物体内,不受组织、环境和发育阶段的影响。(2)RFLP标记的等位基因是共显性的,不受杂交的影响,可区分纯合基因与杂合基因。(3)可产生的标记数目很多,可覆盖整个基因组。但是RFLP标记技术需要酶切,对DNA质量要求高;由于编码基因具有相当高的保守性,RFLP的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放射性同位素,对人体和环境都有害;探针的制备、保存和发放也很不方便。此外,分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。所以,RFLP标记技术的应用受到一定限制。目前RFLP标记技术已经在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究,以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一定的应用和重要的实用价值。3.2CISH(ChromosomeInSituHybridization)染色体原位杂交原位杂交技术最早是由Gall和Pardue利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交建立起来的。其中染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛,它是一种基于Southern杂交的分子标记技术。该技术利用特异性核酸片段作探针,直接同染色体DNA片段杂交,在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针,杂交后通过放射自显影显示杂交信号,也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示原位杂交的优点是准确、直观,缺点是技术非常复杂。3.3SSR(SimpleSequenceRepeat)简单序列重复,即微卫星DNA微卫星是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次串联重复的DNA序列,亦称简单序列重复(SSR)。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,含量丰富,且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域,核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性,这种多态性的信息量是比较丰富的。该技术即是基于基因组DNA重复序列的差异进行检测,不受组织,器官种类、环境条件等因素影响。近年来,微卫星作为一种分子标记,已成为种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一,广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域。对于大多数物种,在第一次开展微卫星研究时首先需要分离微卫星序列,开发特异性扩增引物。目前，关于微卫星分离方法的研究报道很多,概括起来基本上分为经典法、富集法、省略筛库法、ISSR片段扩增法和数据库检索法5种。微卫星具有分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好以及扩增反应所需模板量少、重复性好的优点,而且呈共显性遗传、检测方便、结果稳定。但是,微卫星标记的诸多优点同时也增大了基因型错误判别的可能性。无效等位基因(nullallele)、“结巴”带(stutterbands)、短等位基因显性(shortalleledominance)和等位基因的“扩增丢失”(allelicdropout)现象的发生都可能导致微卫星基因型的鉴定错误。3.4RAPD随机扩增多态性DNARAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)是由Williams和Welsh两个研究小组于1990年分别研究提出的一种分子标记,是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。基本原理是利用一个随机引物(一般为10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段,然后扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离后配合溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹,进行DNA多态性分析。RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同，但对于每个特定的引物来讲。它同目标基因组的DNA序列都有其特定的结合位点、扩增DNA特定的区域片断，如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的插入、缺失等突变,就可能导致这些特定结合位点、扩增片断发生相应的变化。而使RAPD扩增产物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度发生相应变化。从而可以检测出基因组DNA在这些区域的多态性。与RFLP相比,RAPD技术优点有：(1)技术简单，实验周期短,信息量大,检测速度快；(2)DNA用量少；(3)实验设备简单，不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析；(4)不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析；(5)用一个引物就可扩增出许多片段,几乎覆盖整个基因组,而且不需要同位素,安全性好。因此，RAPD技术广泛应用于天然居群内及居群间的遗传变异、种质资源搜集、品种鉴定、种间或属间遗传关系、遗传图谱构建、基因定位与分离等方面的研究。但是，RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差。首先是显性遗传，不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次，RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差。2.5SRAP相关序列扩增多态性SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism)标记是基于PCR技术的新型分子标记技术，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，主要检测基因的开放读码框(ORFs)区域，其原理是利用基因外显子里G、C含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放读码框架进行扩增。此技术具有简便、稳定、容易得到选择条带序列的优点。并且在基因组中分布均匀，适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱构建。但一套SRAP标记引物并不能够对所有的生物都通用，仍需不断开发出适合不同生物的引物。此外，SRAP标记是对开放读码框进行扩增，所以对基因相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少。2.6TRAP靶位区域扩增多态性TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism)是由Hu和Vick于2003年建立起来的一种新型DNA分子标记技术。该技术是利用生物信息工具和表达序列标签数据库信息，产生目标候选基因区域的多态性标记。它是以基因组DNA为模板，采用两个人工合成的长度为16~20bp的核苷酸的固定引物与随机引物。固定引物的设计步骤为:从EST数据库中鉴别所需序列,再采用有关引物设计软件设定核苷酸序列合理长度(18bp)与最适、最大和最小Tm值(53、55、50)，然后从软件自动生成的引物中，挑选比较合适的引物;随机引物设计主要是针对外显子或内含子的特点，设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。利用设计好的引物，通过PCR方法对基因组DNA进行扩增，PCR产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行检测，然后通过放射自显影或银染技术观察不同的带型(即多态性)。通过扩增产物的多态性来反映基因组相应区域(DNA)的多态性，从而形成围绕侯选目标基因序列的多态性标记。与其他方法相比较，TRAP分子标记技术具有操作简单，重复性好，效率高的优点。2.7ESTs表达序列标签ESTs(ExpressedSequenceTags)是在人类基因组计划实施过程中，由美国国立卫生研究院生物学家VenterJ提出的发现基因的新战略。ESTs是指从cDNA文库中随机挑取克隆并对其3’或5’端进行单轮测序所获得的短cDNA序列，一般长度为300~500bp。由于ESTs是短的核苷酸序列，而且根据构建文库时所采用引物的差异，所测定的序列可以是cDNA的各个区段，包括5’末端和3’末端