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花青素的提取、纯化、测定及性质的探讨指导教师齐霞1.综述•花青素在植物中广泛存在，最突出的作用就是使植物呈现五彩缤纷的颜色。在葡萄籽、山楂皮、苹果、茄子皮、桂花、玫瑰花、黑(红)米、牵牛花等都含有大量的花青素。研究表明，紫甘薯中也含有花青素，并且我国盛产甘薯，甘薯种植总面积和总产量分别占世界的62%和84%，紫色甘薯是甘薯的一个特殊品种类型，不仅富含有碳水化合物、维生素、矿物质、食用纤维等营养物质，而且具有抗病、抗旱、价廉、高产等优点。•90年代国内外学者就开始了对紫甘薯色素的常规提取、纯化和稳定性的研究,但是常规提取通常存在时间长、劳动强度大、原料预处理能耗大、热敏性组分易破坏等缺点。目前，紫甘薯花青素主要提取方法包括溶剂浸提法、酶水解法、热水解法、树脂法、超声波萃取法、微波萃取法、超滤法、吸附精制、索氏提取法、热回流法等。另外花青素的定量方法主要是根据其光学特性进行分析,常用的方法有紫外可见分光光度法。早在1958Harborne就撰文讨论了紫外-可见光谱法在花色苷类物质结构鉴定中的应用。2.研究价值•花青素是一类由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成的多酚化合物总称，无毒无味，具有强大的抗氧化活性和自由基清除能力，具有降血压、降血脂、防止动脉硬化、抗癌、抗衰老和美容等功效，已经运用在疾病治疗、保健品和化妆品领域，成为深受各国人们喜爱的天然植物提取物。因此人们对花青素的研究越来越重视，寻找新的富含花青素的原材料和适合于工业化提取、检测花青素的方法是两个研究热点。3.研究方案•拟用三种方法对紫甘薯中的花青素进行提取、纯化、测定、最后探究花青素的稳定性和抗氧化性。4.总的技术路线紫甘薯预处理提取纯化测定性质探究溶剂浸提法酶解法热水浸提法分光光度法pH示差法稳定性抗氧化性4.1提取方法简介•溶剂浸提法：称取粉末→盐酸乙醇溶液提取→沸水浴回流→减压真空泵回收乙醇•热水浸提法：紫甘薯粉末→热水浸提12h→离心机提取上清液•酶解法：甘薯浆→维素酶酶解时间5h到测定4.2纯化•将花青素粗提液倒入大孔树脂让花青素吸附在大孔树脂上，再用10％醋酸水溶液淋洗柱子，最后用7％的乙醇溶液洗脱大孔树脂，将洗脱液用旋转蒸发仪在40℃浓缩后用真空冷冻干燥机干燥成粉状物为花青素纯化提取物。返回4.3测定•方法一：分光光度法•将滤液定容至一定体积，用提取剂作空白对照，采用分光光度法在400-600nm波长范围内进行全波长扫描，得出最大吸收波长。在最佳反应条件下，取基准花青素试剂配制成不同浓度的标准溶液，在最大波长处测定吸光度，绘制标准曲线。•用朗伯比尔定律计算花青素的含量。返回•方法二：pH示差法•首先，是最大吸收波长的确定，其次，在波长确定的条件下确定两个适宜pH，最后是反映平衡时间的确定。在以上三个条件确定下根据TFuleki的研究,结合比耳定律公式A=εbc,得紫甘薯中花青素含量计算公式如下:X=△TVFM×1000εmpH示差法具体操作方法•1）最大吸收波长的确定•取一定量紫甘薯提取液用酸性乙醇溶液稀释至一定体积,使其吸光值在一定范围内,在400-600nm波长范围内进行可见光的扫描,绘制吸收光谱图曲线。可知在可见光谱范围内,紫甘薯中花青素的最大吸收波长。•2）pH的确定•为使pH示差法有较好的灵敏度及准确性,pH的选定对花青素的定量分析具有重要的意义,在选定pH时应考虑以下因素:•在此两个pH处测定的花青素的吸光值差异应是最显著;•单一pH的轻微变动,对花青素吸光值的影响极小;•花青素在所处的两个pH下,应相当稳定。由于花青素只有在酸性介质中是稳定的,因此本实验只测定pH小于7时不同pH条件下花青素溶液在最大吸收波长处的吸光值。并以pH值为横坐标,吸光值为纵坐标作图,在图中选取pH值的轻微变动对吸光度值影响很小的范围,而且在这两个pH值范围内,花青素在酸性介质中具有相当稳定性。综上所述,选择的两个适宜的pH值即可。•3）反映平衡时间的确定•因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式,这4种结构形式在某一pH下处于动态平衡,当pH改变时,动态平衡发生转移。一定时间后达到一个新的平衡。根据上面的叙述在两个适宜的pH下。每隔一定时间测其吸光度,观察溶液吸光度随时间的变化,确定溶液平衡的时间。返回4.4性质探讨•性质一：稳定性•1）光照对紫甘薯中花青素稳定性影响的探究•取5.00ml一定量花青素提取液装于6支试管中，共三组分别在日光直射下、室内自然光及暗处放置不同时间后，在最大波长处测其吸光度A。•2）温度对紫甘薯中花青素稳定性影响的探究•取5.00ml色素提取液装于5支试管中，共四组分别放置于分别在室温(25℃，40℃，50℃，60℃，70℃)下恒温，每间隔一定时间取样一次，迅速冷却后，在最大波长处测其吸光度A。•3）pH对紫甘薯中花青素稳定性影响的探究•分别取花青素提取液5.00ml，分别用NaOH溶液和HCl溶液调至不同的pH值，震荡，在适宜的条件下静止1小时，在最大波长处测量吸光度A。•4）金属离子Fe2+、Ca2+、Zn2+、Al3+、K+、Mg2+离子对紫甘薯中花青素稳定性影响的探究•取6支试管，各加入5.00mL花青素溶液，分别加入浓度为1.0mol/L的含有Fe2+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Mg2+、K+的溶液1.0mL，摇匀，放置1h、2h和4h后在最大波长处测定吸光度A。返回性质二：抗氧化性从紫甘薯花青素的结构可以看出，它具有大量的羟基官能团，有很强的抗氧化活性。•拟用紫甘薯花青素对·OH、O2-和DPPH·的清除能力，并与抗坏血酸进行比较，从而测定抗氧化性。1）花青素对·OH的清除能力•按照姚钰蓉的方法利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。具体方法为在体系中加入H2O2，FeSO4，水杨酸-乙醇，再加入不同浓度的花青素粗品，再加H2O2启动反应，37摄氏度反应30分钟，以蒸馏水作参比，510nm处测定吸光度。考虑紫甘薯花青素本身的吸光值，以FeSO4，水杨酸-乙醇，不同浓度的紫甘薯花青素溶液和蒸馏水作为花青素的本底值。清除率计算公式如下：•清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%•A0—对照液的吸光度，•A1—加入花青素溶液后的吸光度，•A2—不加显色剂H2O2花青素溶液的吸光度。•Vc作为阳性对照2）花青素对O2-的清除能力•使用吴建中的方法，在一系列的试管中加Tris-HCl缓冲液，在分别加入不同浓度的紫甘薯花青素溶液，空白组加入同体积的蒸馏水，再加入邻苯三酚，震荡计时3分钟，加入抗坏血酸中止反应，立即325nm处测定吸光值。清除率计算公式如下：•清除率=(A0-AS)/A0×100%•A0—空白样吸光度，•AS—花青素溶液吸光度，样品本身颜色有影响，用样品加Tris-HCl缓冲液为参比。•Vc作阳性对照。3）花青素对DPPH·的清除能力•精确吸取紫甘薯花青素溶液、和Vc溶液各2mL，分别与DPPH·无水乙醇溶液混合，摇匀后放置30min。，用分光光度计分别测定上述溶液在517nm处的吸光值(A1)。•精确吸取紫甘薯花青素溶液和Vc溶液各2mL，分别与2mL蒸馏水混合均匀后，用分光光度计分别测定各混合液在波长517nm处的吸光值(A2)。•精确吸取DPPH·无水乙醇溶液2mL与水混合均匀后，用分光光度计测定上述溶液在517nm处的吸光值(A0)清除率计算公式如下：•清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A0〕×100%•A0—DPPH·无水乙醇溶液与等体积溶剂混合后在波长517nm处的吸光值；•A1—紫甘薯花青素溶液和Vc溶液为与等体积DPPH·无水乙醇溶液混合后在波长517nm处的吸光值；•A2—紫甘薯花青素溶液和Vc溶液与等体积溶剂混合后在波长517nm处的吸光值。