X射线晶体衍射分析X射线晶体衍射分析

X射线晶体衍射分析X射线晶体衍射分析(X-rayCrystallography,X-rayDiffractionMethods)殷雷梁毅殷雷梁毅(武汉大学生命科学学院)(武汉大学生命科学学院)结晶方法和技术汽相扩散法（Vapourdiffusion）:微量蒸气扩结晶方法和技术散法主要是通过在一个封闭体系内，在能使某种蛋白质结晶的较高沉淀剂浓度的溶液与含有种蛋白质结晶的较高沉淀剂浓度的溶液与含有较低沉淀剂浓度的蛋白质溶液之间发生蒸汽扩散，最后两者达到平衡，蛋白质溶液内沉淀剂浓度逐渐增加使得蛋白质的溶解性降低，达到浓度逐渐增加使得蛋白质的溶解性降低，达到过饱和析出而结晶。这种方法现在使用最为广泛，可以分为悬滴法，坐滴法和三明治法。坐滴法和三明治法。三明治法坐滴法悬滴法晶体是原子或分子在三维空间中周期性重复排列形成的晶体的结构特点晶体是原子或分子在三维空间中周期性重复排列形成的结构。点阵结构：任何能为平移复原的结构称点阵结构。能使点阵结构：任何能为平移复原的结构称点阵结构。能使一点阵结构复原的全部平移形成一个平移群ua+vb+wc，称为该结构的平移群。，，为整数，a，b，c为三称为该结构的平移群。u，v，w为整数，a，b，c为三个非共面的向量。点阵结构与其相应的平移群必存在下列关系：（1）从点阵结构中某一点指向点阵结构中的每列关系：（1）从点阵结构中某一点指向点阵结构中的每一点的向量都在平移群中。（2）以点阵结构中任一点为起点时，平移群中每一个向量都指向结构中一个点。起点时，平移群中每一个向量都指向结构中一个点。点阵结构是很有规律的结构，除了上述的平移群能使它复原外，还存在另外一些能使其复原的对称元素，如对复原外，还存在另外一些能使其复原的对称元素，如对称中心（倒反），镜面，旋转轴，旋转反轴，空间点阵结构中只能容纳有限的几种旋转轴，即二重轴、三重轴、结构中只能容纳有限的几种旋转轴，即二重轴、三重轴、四重轴及六重轴，所以其最基本的对称元素只有七种。晶胞：从一个空间点阵结构中一定可以划出一个平行晶胞：从一个空间点阵结构中一定可以划出一个平行六面体，这一平行六面体称晶胞，每一晶胞可用a，b，六面体，这一平行六面体称晶胞，每一晶胞可用，，c，α，β，γ六个参数来描述，这六个参数称晶胞参数。根据晶胞形状，也就是六个晶胞参数，以及晶胞中所容纳的特征对称元素，可以把不同的晶胞分成七个类容纳的特征对称元素，可以把不同的晶胞分成七个类型，即七个晶系:立方,六方,四方,三方,正交,单斜和三斜。晶系特征对称元素晶胞参数对称元素方向立方4个按立方体的对角线取向的三重轴a＝b＝cα＝β＝γ＝90°aa+b+ca+b六方六重轴（平行于C轴）或六重反轴a＝b≠cα＝β＝90°ca2a＋b或六重反轴α＝β＝90γ＝120°四方四重轴（平行于C轴）或四重反轴a＝b≠cα＝β＝γ=90°caa＋b或四重反轴αβγ90三方三重轴（平行于C轴，按六方取）或三重反轴a＝b≠cα＝β＝90°γ＝120°ca－正交二个互相垂直的对称面或三个互相垂直的二重轴a≠b≠cα＝β＝γ＝90°abc单斜一个二重轴或对称面a≠b≠cα＝γ＝90°b－－三斜无或仅有一个对称中心a≠b≠cα≠β≠γ≠900有时为了获得较高的对称性，把原有晶胞扩大，使成为带心Bravaislattices14uniquecrystallattices把原有晶胞扩大，使成为带心的晶胞，由此在七个晶系中可14uniquecrystallattices的晶胞，由此在七个晶系中可以得到14种不同的布拉菲格子(Bravaislattices)，不带心的晶胞称为素晶胞（P），带心的称胞称为素晶胞（P），带心的称为复晶胞（I，F，C）。ThemorphologyofacrystalisdefinedbythesizeandshapeofasingleunitcellEachspacegroupspecifiesthelatticetypeandthesymmetryoftheunitcell.晶胞参数的特征是各个晶系的宏观表现，晶胞参数的特征是各个晶系的宏观表现，是区分七个不同晶系的必要条件但不是充是区分七个不同晶系的必要条件但不是充分的条件，只有特征对称元素是区分晶系的关键所在。两个对称元素的结合就会产生新的对称元两个对称元素的结合就会产生新的对称元素，在七个晶系中把特征对称元素与基本素，在七个晶系中把特征对称元素与基本对称元素进行组合，就会产生32种不同的对称元素进行组合，就会产生种不同的对称元素组合，这就是32个点群。把所有类型的对称元素与32个点群、14个布拉菲格子，按照一定规则的组合就可得到种空间群（）。SG230种空间群（SpaceGroups）。SpaceGroups65possiblespacegroupsinmacromolecularcrystals由于蛋白质晶体的对称元素只有对称对称元素只有对称轴（旋转轴和旋转反轴），没有镜面及对称中心(倒反)，及对称中心(倒反)，因此蛋白质晶体只有65种空间群。X射线晶体衍射分析的基本原理TheNobelPrizeinPhysics1915TheNobelPrizeinPhysics1915fortheirservicesintheanalysisofcrystalfortheirservicesintheanalysisofcrystalstructurebymeansofXstructurebymeansofX--raysraysTheNobelPrizeinPhysics1915TheNobelPrizeinPhysics1915fortheirservicesintheanalysisofcrystalfortheirservicesintheanalysisofcrystalstructurebymeansofXstructurebymeansofX--raysraysSirWilliamHenryBraggWilliamLawrenceBragg1/2oftheprize1/2oftheprizeUnitedKingdomUnitedKingdomLondonUniversityLondon,UnitedKingdomVictoriaUniversityManchester,UnitedKingdomLondon,UnitedKingdomManchester,UnitedKingdomb.1862d.1942b.1890(inAdelaide,Australia)d.1971DiffractionofX-raysbyacrystal发生衍射的X射线束可视为被晶格面反射形成。晶格面被晶格面反射形成。晶格面间距离d及入射角的关系式为：2d·sin=n·（布拉格定律）。晶体的质量有赖于晶胞中分子的有序性。由于原子的热运动及统计无序性，子的热运动及统计无序性，原子位置不是严格固定的。通常在高衍射角处，X射线通常在高衍射角处，X射线的反射强度会下降。当衍射图案的最高分辨率相当于5Å图案的最高分辨率相当于5Å晶格间距时，分辨率较低，当为2025Å时分辨率一般，Bragg’slawBragg’slaw::22ddsinsin==nn当为2.0~2.5Å时分辨率一般，当为1.0-1.5Å分辨率很高。X射线衍射结构分析主要基于两方面原理:第一是衍射线的方向,即衍射图上斑点的位置,用它可以确定晶胞的大小和形状。衍射线的方向与它可以确定晶胞的大小和形状。衍射线的方向与晶胞大小的关系用劳厄(Laue)方程和布拉格()(Bragg)定律描述，亦可用反射球来示意。第二是衍射线的强度即衍射图上斑点的亮度或第二是衍射线的强度,即衍射图上斑点的亮度或黑度用它可以确定晶胞中原子的空间排布。黑度,用它可以确定晶胞中原子的空间排布。X射线衍射数据收集晶体结构测定所依赖的是物理学上最基本的衍射现晶体结构测定所依赖的是物理学上最基本的衍射现象，一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础。目象，一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础。目前，用于X射线衍射实验的相关仪器发生了巨大的革命，使得收集高质量的X射线衍射实验数据得以革命，使得收集高质量的X射线衍射实验数据得以实现，进一步解析高分辨率的三维结构成为可能。X射线光源用于产生高强度的X射线。目前使用较多的是旋转阳极Cu靶，产生波长为15418Å的X射线。的是旋转阳极Cu靶，产生波长为1.5418Å的X射线。但是快速发展的第三代同步辐射光源，如法国的ESRF（6GeV），美国的APS（7GeV），日本的Spring-8（8GeV）和中国上海的SSRF（35GeV）Spring8（8GeV）和中国上海的SSRF（3.5GeV）等改变了蛋白质晶体学的面貌。首先同步辐射光源强度高，往往要比普通的X射线光源高两个数量级以上，其次，同步辐射光源准直性好，使得晶体衍射点相对收敛，使得收集准直性好，使得晶体衍射点相对收敛，使得收集高质量的衍射数据成为可能。同步辐射光源的应用大大降低了对晶体线度大小同步辐射光源的应用大大降低了对晶体线度大小的要求，如一些很难得到大晶体的膜蛋白（往往的要求，如一些很难得到大晶体的膜蛋白（往往是几十微米的线度）可以进行X射线衍射数据的收集和结构测定；收集和结构测定；此外一些晶胞线度达到1000Å以上的庞大复合物此外一些晶胞线度达到1000Å以上的庞大复合物体系的晶体，如免疫复合物，病毒以及核糖体晶体等，获得很大的机遇。体等，获得很大的机遇。这些晶体在普通的X射线光源下衍射往往不这些晶体在普通的X射线光源下衍射往往不好，但是在同步辐射光源上可能收集到高质好，但是在同步辐射光源上可能收集到高质量的衍射数据，进而使结构测定成为可能。同步辐射光源的第三个优点就是波长连续可调，这是同步辐射X射线源有别于普通X射线源的重要特点，这使得利用硒原子反常散射源的重要特点，这使得利用硒原子反常散射效应的多波长反常散射法测定相角成为可能，效应的多波长反常散射法测定相角成为可能，加快了蛋白质三维结构解析的速度。低温液氮气流冷却技术取得很大的发展，自20世纪年代以后，它逐渐用于射线蛋白质晶体学的研90年代以后，它逐渐用于X射线蛋白质晶体学的研究中，用于解决高强度X射线对蛋白质晶体的辐射损伤问题，延长晶体的寿命。这个技术的广泛使用大大有利于蛋白质晶体的储存和运输，促进了完整大大有利于蛋白质晶体的储存和运输，促进了完整的X射线衍射数据的收集。采用低温冷冻技术需要添加防冻剂以保护晶体免受“冻伤”，并避免产生“冰环”，首先要尽可能去“冻伤”，并避免产生“冰环”，首先要尽可能去干净长晶体的母液，同时摸索最适宜的防冻剂条件以及最优的操作方法。以及最优的操作方法。在适宜的防冻剂下，一颗好晶体在液氮低温气流下就已经足够收集一套或多套完整的X射线衍射数据。CryocoolingefficientlyprotectsthecrystalsCrystalsarerapidlycooled(NOTFROZEN)tonearliquidnitrogentemperature;Reducedthermalvibrations;Reduceddisorder;Increasedresolution;Increasedresolution;Reducedradiationdamage;X射线衍射数据处理射线衍射数据处理整个晶体衍射数据收集和处理流程图在实际中，每曝光一次只能收集晶体一个方向的衍在实际中，每曝光一次只能收集晶体一个方向的衍射信息，而通过连续变换晶体的取向，可以收集到射信息，而通过连续变换晶体的取向，可以收集到完整的晶体空间衍射信息，这些衍射点信息需要进一步指标化和积分处理。目前已经开发出成熟的数据处理程序，如Denzo和目前已经开发出成熟的数据处理程序，如Denzo和Scalepack程序。Denzo程序用于对衍射点进行自动指标化，以求出每个衍射点的（h，k，l）指标