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中华卵索线虫（Ovomermissinensis）DEAD-box家族基因Osvbh-1的克隆与表达分析王伟娜，曹梦西，赵娜娜，李神斌，周青春，王国秀*（遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，华中师范大学生命科学学院，武汉430079）摘要：通过同源克隆策略，克隆了中华卵索线虫（Ovomermissinensis）DEAD-box家族基因Osvbh-1的全长cDNA序列。该基因全长2596bp，含开放阅读框2237bp，编码701个氨基酸，推导的氨基酸序列具有DEAD-box家族蛋白共有的保守结构域，与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）vbh-1基因高度同源（80%）。荧光定量PCR分析结果显示，该基因可能为母源性基因；其表达量随着性腺成熟逐渐降低；推测该基因可能与中华卵索线虫生殖细胞的发育有关。关键词：中华卵索线虫；DEAD-box；Osvbh-1；克隆；表达分析；生殖细胞索科线虫（Mermithidae）是一类宝贵的昆虫天敌资源，生防潜力极大[1-2]。具有寄生期营养竞争压力决定其性别分化的特殊性别分化机制，即每一昆虫体内寄生的线虫越少，每条线虫所获得的营养就越多，其越有可能发育为雌虫，相反则为雄虫[3-4]。有关学者试图以体外培养的方法实现该线虫的产业化，以满足生物防治的需要，但未获最后成功，关键瓶颈问题是体外培养的线虫性别未分化成熟[5]。因此，对于中华卵索线虫性别分化机理的研究，一方面可以帮助解决体外培养中线虫性别未分化成熟问题，促进实现该线虫的商品化生产以满足生物防治的需要；另一方面作为营养竞争压力决定性别分化类型的典型代表，可以丰富性别分化机理的理论研究。目前关于该线虫性别分化机理的研究仅停留在形态学观察及生理生化成分分析上[6-8]，对于功能基因及功能基因组等分子生物学研究至今还未见报道。在研究中华卵索线虫的性别分化的过程中，拟解决的关键问题之一即确定线虫性别开始分化的关键时期。李俊莉（2006）等通过组织切片的方法从宏观角度观察到性腺发育起始于寄生后期幼虫蜕皮的阶段[8]，但该方法始终无法精确的确定该线虫生殖腺发育的起始时期。对于性别分化分子机制的研究，发育生物学基础是必不可缺的，如生殖细胞发生的时间以及迁移、转化的规律等，明确了这些，我们可以较为准确地掌握中华卵索线虫性别开始分化的临界时期，即关键期，才能通过更有效、简便的手段获得调控中华卵索线虫性别分化的关键基因，以及深入研究这些基因之间的相互作用，参照模式生物的研究成果，最终得到索科线虫的性别分化机制。DEAD-box家族是一个ATP依赖的RNA解旋酶家族,广泛存在于细菌、酵母、植物和动物中[9-11],核心区内9个保守的序列区共同决定了DEAD-box家族蛋白的ATP依赖的RNA解旋酶活性[12-13]，如图一所示。该家族是以其中一个保守域D-E-A-D（Asp-Glu-Ala-Asp）命名的[9,14]。DEAD-box家族的主要成员一般被分为VASA、PL10、p68、eIF4A等亚家族[15-18]，VASA和PL10亚家族参与了生殖细胞发生的多个重要环节，其中PL10基因最初在小鼠精巢中获得[15],其相关蛋白广泛存在于从酵母[19-20]到植物[21]和动物[15,22-26]的真核细胞生物中,氨基酸序列高度保守，它们能结合DNA、RNA、ATP等,具有依赖ATP的RNA解旋酶活性[15]。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）中存在VBH-1（VasaandBelle-likehelicase）蛋白，属于该家族成员之一，在性腺中特异表达，参与雌雄同体个体生殖腺精卵细胞的转换过程，在生殖发育过程中发挥重要作用[27]。图1DEAD-box家族保守结构域本研究采用分子生物学的手段，通过同源克隆的方法，以与生殖细胞发育密切相关的DEAD-box基因家族为研究对象，首次在中华卵索线虫中获得了与秀丽线虫vbh-1基因高度同源的基因，并将其命名为Osvbh-1。1材料与方法1.1材料及试剂准备中华卵索线虫怀卵雌虫于2001年3月采自河南省上蔡县小麦农田，室温(26士1℃)条件下产卵、孵化出感染期幼虫(II期幼虫或寄生前期幼虫)后，在本实验室通过宿主棉铃虫体内培养进行传代。收集胚胎发育期卵、寄生前期幼虫、寄生期幼虫（2、4、6天）、寄生后期幼虫、雌/雄成虫、怀卵雌虫，液氮冻存备用。总RNA提取试剂盒（SVTotalRNAIsolationSystem）购自Promega公司，荧光定量试剂盒（SYBRGreenPCRMix）、MLV反转录酶、ExTaqTM、pMDTM18-T载体连接试剂盒、胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，SMARTTMRACE试剂盒购自Clontech公司，其余均为国产分析纯试剂。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。表1-1列有本试验中所使用到的所有引物。表1-1引物序列一览表引物名称引物序列RT-PCR简并引物vSATGGCNTGYGCNCARACNGGvAAARCCCATRTCYARCATNCGATC5’RACE基因特异引物5GSPACGTCGATCAATCGCCCAGGAGTA5NGSPCAAAATGGCGGATTGTATGGGCGT3’RACE基因特异引物3GSPACCGAACGAAGTTGGAGGCAATGG3NGSPCCGCCGTCGTCATTACCCGATAGC特异引物vL/vRCTATACCCACTGCATTAGAGCATTGCCTCCAACTTCGTTCaL/aRACACCGTTCCCATCTACGAAGTCCAAAGCGACATAGCACASMARTTMRACE试剂盒提供引物SMARTIIAOligonucleotideAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3'-RACECDSPrimerA(3'-CDS)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N(N=A,C,G,orT;N-1=A,G,orC)5'-RACECDSPrimer(5'-CDS)(T)25N-1N(N=A,C,G,orT;N-1=A,G,orC)10×UPM(UniversalPrimerAMix)Long(0.4mM)CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTShort(2mM)CTAATACGACTCACTATAGGGC10μMNUP（NestedUniversalPrimerA）AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT1.2RNA提取、cDNA的准备、克隆及序列分析取发育各期中华卵索线虫，参照Promega公司总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。根据已报道的秀丽线虫、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠等物种的DEAD-box基因家族cDNA序列，选择保守性高的位点设计简并引物vF/vR，取各时期混合RNA按操作说明进行RT-PCR反应。产物纯化后与载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp的LB平板中，挑取单个白色菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养，经菌落PCR检测后送南京金思特生物科技公司测序。使用DNAman、Lasergene、Clustalw等生物软件进行序列分析，Blast搜索在NCBI()网站上进行。1.3Osvbh-1基因cDNA全长的获得利用SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech)进行。以中华卵索线虫总RNA为模板，分别合成带3’接头和5’接头的cDNA第一链。以带3’接头的cDNA第一链为模板，3GSP和UPM为引物，进行3’端的cDNA扩增，将扩增产物稀释50倍后，以3NGSP和NUP为引物进行巢式PCR扩增（设置对照组：3NGSP+ddH2O、ddH2O+NUP作为对照）；同样的方法进行5’端的cDNA扩增；将巢式PCR扩增产物切胶回收后分别用载体连接,经Amp抗性筛选和重组质粒PCR鉴定后，送南京金思特生物科技公司测序。测序结果拼接后得到中华卵索线虫Osvbh-1基因的全长cDNA序列。开放阅读框（ORF）预测采用Finder软件（http：//），预测氨基酸序列，并与Genbank中其他物种的相关序列进行比对分析，利用MEGA4软件，NJ法建立氨基酸的系统进化树。1.4荧光定量PCR分析Osvbh-1基因在中华卵索线虫各发育时期的表达情况根据已测得的Osvbh-1基因全长序列、已知的参照基因actin的全长序列设计特异性引物vL/vR、aL/aR，参照大连宝生物公司SYBRGreenPCRMix试剂盒操作手册进行荧光定量PCR。每个样品做3个生物学重复，参照基因与目的基因同步检测，数据处理采用2-△△CT法[28]。2结果与分析2.1中华卵索线虫Osvbh-1基因cDNA的获得以中华卵索线虫各时期混合总RNA为模板反转录PCR，扩增得到450bp左右的DNA片段。将该片段回收、克隆、菌落PCR检测后测序。经Blast软件分析，该片段长度为464bp，包含部分DEAD-box结构域。通过5’、3’RACE技术分别扩增得到一条长度约为1719bp和994bp的片段。Blast分析表明，核苷酸序列与预先得到的片段分别有234bp和347bp的重叠，与已获得的中间序列进行拼接，即得中华卵索线虫Osvbh-1基因的全长cDNA序列。2.2中华卵索线虫Osvbh-1基因的序列特征分析中华卵索线虫Osvbh-1基因cDNA序列全长2596bp：其中开放5’UTR187bp、开放阅读框（ORF）2237bp、3’UTR170bp，包含起始密码子ATG，终止密码子TAG，3’UTR含有26个碱基的poly(A)尾，在poly(A)尾上游37bp处可见单一的poly(A)加尾信号序列ATTAAA。如图2-1。预测中华卵索线虫Osvbh-1蛋白由701个氨基酸残基组成，分子量75.780KD,等电点为11.07,包含所有DEAD-box基因家族的所有结构域：F，MYDKPTVG，AQTGSGKT，PTREL，GG，TPGR，DEAD，SAT，RGLD，HRIGRTGR，如图2-1。证明所克隆的中华卵索线虫Osvbh-1基因为DEAD-box家族基因。其中AQTGSGKT对应于AXXXXGKTmotif，位于其氨基酸N末端第301-308位，该区域为ATP酶A-motif，是ATP的结合位点；第423-426位的DEAD保守区为ATP酶B-motif，为ATP水解部位，在所有DEAD-box家族成员中均保守存在；SAT和HRIGRTGR保守区在一些DEAD-box家族蛋白中则被认为与RNA的结合及解旋有关[29-30]。图2-1中华卵索线虫Osvbh-1基因全长cDNA核酸序列及其编码的氨基酸序列cDNA顺序为5’-3’；引物、起始密码子ATG、终止密码子TAA及末端加尾信号ATTAAA均以下划线标出，DEAD-box结构域以方框标出。选择部分较典型的DEAD－box家族成员蛋白，涉及VASA、PL10和P68三个亚家族，采用多序列比对软件ClustalW和进化树构建软件Mega4，以邻位相连法（Neighbor-Joining，NJ）构建进化树。该进化树根据GenBank上已注册的VASA、PL10及P68蛋白的氨基酸全长序列构建。多序列比对等参数的设置采用默认设置值。构建的进化树如图2-2所示。图中显示，所有VASA、PL10和P68亚家族成员均各成一支，表明尽管它们同属于DEAD-box家族，但各亚家族之间仍存在较大差异，同一亚家族成员之间比与其他亚家族成员具有更高的相似性。同时也显示出本实验中得到的全长cDNA编码的蛋白序列与PL10亚家族成员的进化关系明显近于VASA或是P68亚家族蛋白，且与秀丽线虫等的vbh-1蛋白聚为一支，然后再与斑马鱼（Daniorerio）等物种的PL10蛋白聚为一大支，进一