中压色谱柱应用介绍

中压快速制备色谱培训李运华博纳艾杰尔如何快速高效的完成分离•选择合适的洗脱梯度•选择合适的柱子规格•选择合适的洗脱溶剂•选择合适的上样方式，及上样量选择合适的洗脱梯度快速纯化中的洗脱类型TLC方法建立1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10riginRfFlow-------10.005.003.332.502.001.671.431.251.111.00CVFlashFlowTLC•最优的Rf(0.15–0.35)•洗脱过程需要考量的参数如下–最优的分离度–最大的进样–最小的溶剂损耗TLC方法与柱层析的关系BABABA012345678910ColumnVolumes0123456789100123456789101.9.8.7.6.5.4.3.2.101.9.8.7.6.5.4.3.2.101.9.8.7.6.5.4.3.2.10RfA=.80RfB=.67Rf=.13RfA=.47RfB=.34Rf=.13RfA=.32RfB=.18Rf=.14CV=0.24CV=0.8CV=2.4ABOriginOriginOriginABAB次级保留效应•硅胶为基质的填料中，有些样品组分能与硅醇基团相互作用，脱附的过程很慢，使峰严重拖尾•对付次保留效应最有效的方法就是选用封尾更好填料或加入流动相改良剂（也叫扫尾剂）理想的梯度方法•理想的快速分离中，待分离化合物应在3-6个体积内洗脱下来•两个相互分开的物质，其CV应在1以上分析梯度感兴趣化合物SettingCollectionviaUVwouldbecompromisedbystrongerabsorbinginterferents制备梯度选择合适的柱子•在分析型HPLC中，色谱柱填料的颗粒大小是一个十分重要的参数。颗粒越小，分离效率越高。这样，就可以使用较短的柱子以提高分离速度。•在制备型HPLC中，颗粒的的大小同样重要。但是由于制备型HPLC经常使用超载进样，所以分析色谱常用的3.0-5μm的颗粒在制备色谱柱中不经常使用。另外一个原因是填料的颗粒越小，价格越高。在高压制备色谱中常用的填料颗粒尺寸为10μm。•在中压制备系统中常用的40-60μm，20-35μm和20μm填料•色谱柱的内径和长度正比于进样量。内径越大，长度越长，可承受的进样量越大。填料及柱尺寸填料粒径的影响30µm5µm123t[min]柱串联技术的优势1.2minRunTime(Min)246810121416RunTime(Min)2468101214161.8min柱串联技术是一个可以显著提高分辨率的有效工具，是一个分离复杂样品的简单技术，无需对硬件或溶剂作很大改变。每增加一个柱就可以提高分辩率，可增加柱直到达到需要的分离效果。而且如果发生填料污染只需要更换最上端一支柱子3根4克柱串联一根12克柱键合相填料的化学反应C18键合硅胶键合+SiOHSiClR1R2SiOSiR1R2C18最常用的，对小极性物质保留好C8对小极性物质保留略比C18低AQC18可用100%水相的C18Hilic键合丙烯酰胺基团，适合大极性物质分离silica常规硅胶CN(cyano)保留适中，可用于正相和反相NH2(amino)保留较弱，适合碳水化合物，寿命较短常用色谱填料•90%的液相色谱可以通过反相色谱完成•反相液相色谱流行的主要原因:耐用、重现性好的色谱柱技术溶剂安全且较易得到反相液相色谱检测较为简单•许多使用液相色谱的人都有应用反相液相色谱的经历然而，在制备色谱中使用反相色谱常常会遇到问题.反相色谱•反相液相色谱制备中的两个主要问题:–部分化合物在反相LC中的溶解度很低–反相LC的馏分需要较长时间的浓缩干燥；而长时间的干燥可能造成馏分产物的变性或水解•在正相LC条件下这些问题可以得到解决反相色谱•正相色谱使用的溶剂使得馏分浓缩时间缩短•可以提高一些样品的溶解度(增加样品的进样量)•可以解决反相色谱不能解决的问题•手性填料正相色谱合适的流动相•截止波长•乙腈——190nm•甲醇、异丙醇——205nm•乙醇、石油醚、MTBE——210nm•四氢呋喃——230nm•乙酸乙酯——260nm•正己烷、水——200nm•乙醚——220nm•丙酮——330nm•甲醇、乙腈与正己烷、石油醚不互溶正相色谱中流动相选择•ACN与MeOH的比较(70%的反相HPLC是使用ACN)•ACN的优点-低粘度，低压力，峰形好-强洗脱剂-空气的溶解度低-低UV-吸收(195-200nm)-pH变化小-溶解性好•缺点-毒性-盐溶解度差(缓冲溶液)-旧乙腈中的杂质(propionitrile,methacrylnitrile)。乙腈和甲醇比较乙腈与甲醇混合强度比较%ACN%MeOH%ACN%MeOH57556510146070152165742028707825347582304080863545859040509095455595985060100100•MeOH/H2O+5-25%•ACN——选择性地加快醚类的流出•THF——选择性地加快含甲氧基化合物的流出•ACN——保留含甲氧基化合物•CH2Cl2——选择性地加快含氯化合物的流出•THF——与环形化合物比较，加快含有直链化合物的流出•DMF——加快碱性化合物（芳胺，含氮杂环化合物）+减少拖尾•水用于调节极性反相色谱中三元流动相制备色谱中挥发性缓冲盐•进行制备型液相色谱分离时，所用溶剂的纯度很重要。即使含纯化合物的流动相溶剂中含有微量的不挥发性杂质，当大量溶剂经蒸发后，其杂质浓度就会增高。制备型液相色谱往往需消耗大量溶剂，因此应在溶剂纯度(和价格)与所用数量之间进行权衡。•1ppm杂质=1mg杂质/升流动相例如:流动相中1ppm杂质及20mL馏分中有1mg化合物1/50mg杂质98%纯度对于纯度要求很高的制备色谱，要求溶剂的纯度也要高(溶剂可能会成为主要的污染源)流动相纯度•选择制备色谱流动相要考虑的几个因素–流动相有利于分析物达到最佳的选择性–流动相的光谱特征（UV/荧光/质谱）–容易从最后馏分中除去–粘度低以降低柱反压–流动相中难挥发性杂质的含量–对样品有好的溶解性–溶剂的成本–流动相添加剂流动相选择制备色谱进样上样方式的选择1)正相色谱柱的载样量较大,一般样品与填料的质量比能达到1:10或更高。2)根据样品不同的分离难度,每个样品的上样量有所不同,分离度越小则上样量越小，一般上样量与色谱柱填料比一般要大于千分之一。3）一般采取固体上样方式.拌样使用的填料一般和柱子填料类型相同,或粒径可以大些，拌样以把样品完全吸附且均匀为准,一般样品和填料比1:1即可.当使用极性较大的溶剂拌样时,溶剂要旋干.上样柱上样高度一般要小于柱长的20%。4)当样品的溶解性较好,可以溶解在洗脱力较弱的流动相中时,也可以将样品溶解在弱洗脱力流动相中,液体进样。干法上样的好处–快速纯化时，许多样品的溶解度低，如果用于溶解样品的溶剂强度高于流动相，此时强溶剂的存在会干扰流动相的洗脱，造成样品的共同洗出，显著降低纯度。此时宜采用强溶剂溶解样品后与硅胶混合，再除去溶剂后进行干法上样。•在分析色谱中，柱容量一般定义为使柱效降低10%时的进样样品质量。•在制备色谱中，对柱容量的定义无需定义的十分精确。因为在制备色谱中，实际进样量可以高出其线性进样量很多。常常是数量级的差别。•制备色谱超载进样的超载程度是当无法达到预期的纯度及回收率时的进样量。•根据样品在进样溶液中的溶解度不同，进样量也会有很大的不同。•如果相对于流动相而言，进样溶液的强度太强，色谱柱就会体积超载。在进样时样品就会纵向扩散。•最佳的情况是进样溶液比流动相相对弱一些。这样，样品在进样时可以集中在柱头部分。•有许多条件会影响进样量：如采用梯度洗脱、样品组成成分简单则可以增加进样量；反之则要减少进样量•中压色谱中干法上样方式比较普遍合适的进样方式和进样量•如果被分离化合物的溶解度很低，超载一般都是以增加进样体积来实现的。这种超载进样称之为体积超载：•增加进样体积将导致峰变宽，并且渐渐趋近于矩形，但是色谱峰依然保持对称。•当体积不断增大时，色谱峰会出现重叠甚至变形。体积超载•当进样的样品质量超过一定量，样品在色谱柱的浓度会很高，以至色谱平衡被破坏。这种情况称为质量超载。质量超载的情况比体积超载要复杂的多。在质量超载情况下会出现三种效应：•散射效应样品在流动相的作用下会沿着柱子散布直至与固定相充分的接触达到平衡。这种现象会导致色谱带增宽。•填料的失活由于大量的样品进入色谱柱导致填料的活性基团被占据。从而改变了流动相的极性作用。其结果是保留时间减少。•非线性吸附等温线由于样品浓度高，色谱峰产生拖尾质量超载0.18mg16.9mg8.1mg填料容量检测器•最常用的检测手段•在一至两个波长下给出化合物的相对吸光率•信号是基于比尔定律A=eBCA=吸光率e=分子在指定波长下的吸光率B=光程长度C=浓度•色谱信号取决于样品浓度及分子吸光率。•较为便宜紫外检测器•近乎通用型检测手段–分析物的挥发性必须低于洗脱液–与分子吸光度及离子化无关•信号只取决于分析物的质量或浓度•没有定性数据，只有定量数据•可以使用梯度洗脱，但是需要分流ELSD检测器•近乎通用型检测手段•直接连接检测器，不用分流，回收率高。•不可以使用梯度洗脱RI检测器质谱检测器（实验室）在线离子导向•直接将MS连接在色谱流路上进行实时检测。•可以按照指定质量数选择性地收集馏分•需要十分复杂的系统流路及十分精确的分流方案主动分流器•提供样品的离子数据•如果样品可以离子化，就可以有效地定量分析信号的强弱取决于离子碎片的浓度制备条件：色谱柱：FlashC18（20-45µm100Å12g四支串联）；流动相：A:0.1%FA水溶液B:乙腈检测器：UV260nm（红线），210nm（蓝线）；流速：20mL/min；上样量：0.5mL检测条件：分流比：500:1辅助泵流速：0.2mL/min辅助泵流动相：甲醇：水=70:30离子源：ESI模式：Pos分子量范围：150-600Da数据输出端口：AO1Cheetah工作站option：DAQ-5~5V质谱数据参数设置：Output1MaxIntensity100*109MaxVoltage5中压质谱联用案例馏分收集•仅收集峰的中间部分，峰的开始部分及结尾部分不要。•这种收集方式的特点是组分的纯度大大提高。收集方式收集方式discarded88%88%B12%A88%A12%B98%A2%B98%B2%A收集方式微量组分分离谢谢！客服：400-606-8099网站：邮箱：[e-mail]