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1一、是非判断题：（每题1分，共15分。用对错标识于题前括号中）（错）1、酶的活力测定即是酶的定量测定，根据酶所催化反应的可逆与否，确定是测定反应初速度或是达到平衡时的速度。（错）2、凝胶过滤技术和电泳技术中都利用了分子筛效用，实验过程中都是大分子迁移速度快。（错）3、蛋白质凝胶电泳制胶时，由于夹层胶室极薄，灌注分离胶后胶面往往不是很平直，所以需立即小心于其上覆盖一薄层蒸馏水，从而使聚合后的胶面平整。（错）4、层析介质多是多碳链高聚物，为防止微生物侵染需要低温保存，所以灌胶后上样前一定要充分洗脱平衡使温度一致。（对）5、移液器（枪）使用前和使用一段时间后都需要校正，以确定取液精度和准确度。（对）6、生物材料中特定物质的相关测定必须注意个体差异，取材要足够广泛数据才基本可信。（错）7、蛋白质含量测定前人建立了多种方法，我们只要从中选择最简便易行的方法即可。（对）8、蛋白质电泳制胶后剩余的分离胶和浓缩胶应该待其聚合后再弃置并清洗小烧杯。（错）9、这学期做的血红蛋白凝胶过滤的试验中，我们利用凝胶过滤技术实现了蛋白质之间的分离。（错）10、在利用容量瓶作为生物样品的浸提定容器皿时，为保证容积精准要注意先定容再充分浸提。（对）11、鉴于生物样品的未知性，所以样品测定时需要做多个平行以消除操作误差的影响。（错）12、生物样品在匀浆或搅拌时难免产生较多的气泡，但对实验没有太大影响。（对）13、用于分离纯化物质时，电泳技术和层析技术在一次性可负载上样量上是完全无法比拟的。（错）14、利用凝胶过滤层析分离物质时，层析柱越长分离效果越好。（错）15、活性电泳与变性电泳在电泳结束后都必须立刻将凝胶板置于固定液中固定以防条带扩散。二、问答题（共55分）1、请从理论上和实际操作两方面分析透析技术和凝胶过滤技术在完成蛋白质脱盐上的异同和优势比较。（10分）透析是利用半透膜对小分子的通透性以扩散的方式完成从大分子体系中去除小分子，需要不断更换透析液以保持较高的浓度梯度，耗时较长，且理论上不可能达到百分百分离。且透析袋体积不能过大，否则扩散效率更低，从而限制了处理的样品量。凝胶过滤层析是利用合适孔径的凝胶颗粒（比如交联葡聚糖G-25），将分子量的差异转化为洗脱速度的差异，而速度的差异可以通过距离的累计完成彻底的分离，无机小分子较之蛋白质分子，二者分子量差异大，所需完成分离的距离（柱长）就较短，所需时间也较短；而且层析柱等比例放大不会改变层析效应，但上样量却可以增加。综上，凝胶过滤层析脱盐从理论基础到实际应用，完成脱盐的分离效果和用时都比透析更胜一筹。但所需的技术成本和操作技巧凝胶过滤层析也要求更高。22、你认为实验结果分析应该包括哪些基本环节？（15分）（这道题根据实验领域、对象、特点的不同，是有各自不同的针对性的考虑的。咱们自然更多的是反映做过的这些实验在结果分析方面一般要注意的。要强调的是，结果分析到结论的得出是一个实验最最重要的，也是最最培养和体现你们自主思维的环节。但却往往是学生实验中最被你们忽视甚至完全漠视的。结果的合理与否、数据的可信与否好像都与你们没有任何关系，完全交给老师去评判。这钟思维惰性是很可怕的，请大家一定注意要有一种急迫意识，随时提醒自己矫正。）（1）明确表述实验所获得的相关结果。（2）实验操作中是否有会较大程度影响结果的操作误差？会导致结果怎样的可能偏差？是否在操作误差允许的范围内？（包括所使用仪器的精度等）（3）针对生物类实验，尤其要注意取材是否合理？对生物的共性与个性必须有客观全面的估计。（4）实验结果与实验前分析预计的是否相符？不相符，可能的原因分析。（5）与已有的较为公认的观点看法、数据是否一致？不一致，可能的原因分析。综上，对于实验结果的合理性、可信度等做出明确判断，由实验结果自己进一步的新的思考等，即结论与展望。（本题具有一定的自主灵活性，大家回答中合理的想法都将被重视，并丰富到我们后续的教学中。）3、简述离心机的使用注意事项。（10分）离心管平衡配重、离心管规范放置、机舱盖盖好、时间转速设置、速度稳定无异常后离开，随时关注其状态。速度为零后，明确开仓信号，适度力度打开机仓盖。运行中任何异常直接断电，切勿习惯性想开盖看看…………（使用低温冷冻离心机还要注意提前开机预冷，转子应该置于冷柜中存放）4、孙小美在研究蜘蛛的消化酶，她提取了100只蜘蛛的消化液，得到一份蛋白质样品，孙小美想看看该样品中有几种蛋白酶，于是她选择了SephadexG-25凝胶对该样品进行凝胶过滤分析，由于实验室的恒流泵很不巧坏掉了，可是她实验赶时间，于是就利用重力洗脱进行层析，并利用紫外检测仪在280nm对流出液实时进行监测，发现经过层析只得到一个洗脱峰，于是孙小美推断该样品中很可能仅含有一种蛋白质。请问她的推断正确吗？为什么？（10分）自然是不正确咯，SephadexG-25是蛋白脱盐用的凝胶型号，说明其交联孔径很小，被称为蛋白质的分子理论上都是进不去的，会较为快速从凝胶颗粒间洗脱下来，这样所有的蛋白质便会以一个洗脱峰呈现。加之重力洗脱往往速度较快，洗脱液“冲力”过大，会使得原本能够进入颗粒内部的分子或因分子量差异而洗脱速度有差异也体现不出来。综上，小美同学的推断是绝对不正确的。5、路飞在研究丁香花瓣中的过氧化物酶同工酶，他将1g丁香花瓣加蒸馏水研磨匀浆后离心，上清定容到10ml，取其中1ml加入蔗糖到终浓度40%，加入适量溴酚蓝进行活性电泳，经Tris-HCl-Gly不连续缓冲系统电泳后经联大茴香胺染液染色后观察，发现丁香花瓣提取物中呈现7条带，考虑到电泳是一种灵敏度非常高的分析鉴定手段，路飞得出结论，丁香花瓣中总共有7种过氧化物酶同工酶，未来他将通过凝胶过滤3等分离纯化手段对这7种过氧化物酶同工酶分别进行分离纯化并做进一步研究。请问路飞以上的研究分析中有何不当之处吗？为什么？（10分）路飞同学的结论也是不对的，或说至少太武断，考虑不全面。Tris-HCl-Gly不连续缓冲系统是碱性体系，在此体系中带负电荷的样品才能有效分离，如果带电荷量不足或带不上负电荷则无法被分离的。咱们以小麦幼苗为材料进行的过氧化物酶同工酶分析，大家应该还记得，在分离胶顶端甚至浓缩胶里都有条带，这一方面与凝胶浓度有关另一方面与酶所带电荷也有关，所有综合分析，路飞认为仅有七种同工酶是不对的，应该是至少有七种才对。三、纠错题：钱多多和艾美丽一起做淀粉酶活性测定的实验，以下是他们的实验操作，请你指出其中操作不当之处并说明理由。（请在不当操作下划线示意，然后于右侧对称位置阐述理由。共30分）1.钱多多去取了一把麦苗，艾美丽把天平从盒子里取出来放在桌上，游码调到2g的位置，钱多多把麦苗全放在天平上，发现多了一些，于是拈出3根，啊哈！一下子天平就平啦！“圣手钱多多呀！”二人都很兴奋！（应挑选已经萌发的麦种，吸去根部外面挂的的水分，天平自身平衡要先确定。）2.钱多多把称好的麦苗一股脑倒进研钵，加入石英砂和适量去离子水开始研磨，研磨成完全看不到固体的匀浆状态，艾美丽已经准备好了容量瓶，艾美丽拿过研钵利用引流口将匀浆糊状液体倒入容量瓶，然后熟练的用洗瓶冲洗研钵后将液体也倒入容量瓶，反复冲洗了3遍，他们认为研钵已经洗干净了，于是对容量瓶定容，放置一边。（冲洗不以次数论，少量多次，既要观察研钵中的情况，保证转移完全，但只要还可以增加浸提体积都先洗涤研钵为最佳；生物样品原则上先浸提后定容，根据材料溶剂化程度情况，具体问题具体分析。而且样品的浸提是要不断上下颠倒以保证内容物的充分释放，而不是放置一边完全靠静止浸泡。）3.二人商议后决定利用这段时间开始准备标准曲线，钱多多负责加蒸馏水，艾美丽负责加麦芽糖标准液，钱多多每次取液后都将枪头伸到试管底部打出液体，艾美丽则习惯让枪头刚深入试管后就贴壁打出液体，这样可以尽可能减少枪头的污染。（科研中工作中，对于同一个实验体系，一个人加所有液体，系统误差是最小的，但在学生实验中，考虑到实验训练和时间没有强调。移液器加液时枪尖的位置没有绝对的规范，关键就是保证移液的精准和不受污染。习惯伸到底部要防止试管内已有试剂的溅染，靠壁加要防止各试剂靠壁点的交叉污染，和液体挂壁的损失。）4.钱多多加到第5根试管的时候吸液体速度太快，枪头里吸入了气泡，他习惯性的加入了试管中，但是马上又反应过来，于是赶紧把试管去洗干净拿回来重新加了一次，这次吸液速度不快也不慢，刚刚好！（试管洗涤后，内侧残余的蒸馏水的对于淀粉酶实验体系的影响是不可忽略的，所以应该另换干燥的试管以保证实验误差在允许范围内。）5.标准曲线很快加完了，样品也浸提的差不多了，于是他们把容量瓶中的液体转移到离心管，拿过平衡天平，把两个塑料离心管放进天平两侧的小杯子中配平，然后将离心管装入铁套筒，对称放入离心机，3500rmp离心15分钟。（必须带着铁套筒一起平衡啦）6.他们抓紧离心的时间，将标准曲线拿去沸水浴反应5分钟，回来稀释，定容到15ml。（比色法最大的误差来源就是标准曲线与样品操作不同步造成的，所以沸水浴必须等样品一起。）7.离心结束，取出离心管，钱多多从离心管中每次吸取1ml上清液，四次，分别装在4根试管中，捆好然后去进行β-淀粉酶的70℃钝化，而艾美丽则从中取出5ml上清液稀释定容用于全酶的测定。（离心过程不是一个混匀液体的过程，所以上清液必须全部转移到合适的容器内，混匀后取用。）8.他们把经过钝化得到的α-酶样品和全酶样品，按照要求在对照管中加入了NaOH，并一起放入水浴锅里的试管架上，按照实验步骤要求的开始做酶学反应实验。（最适pH环境要加缓冲液保证）49.淀粉由艾美丽负责加入，艾美丽是左撇子，她从右向左依次向8根试管加入2ml淀粉，加到第5根的时候兜里的手机震动了一下，这时候艾美丽刚取出淀粉准备加入第5根试管，手机的震动使她手抖了一下，淀粉撒出一滴，于是她很镇定的重新取液后再加入试管。（实验过程应该杜绝一切干扰，而且测定管的酶促反应启动应该有格外的重视。）10.加完样，艾美丽才接电话，电话是孙小美打来的，她问艾美丽有没有看到她的兔耳朵发夹，晚上排练元旦晚会节目需要用，艾美丽告诉她应该是放在宿舍靠窗的桌子抽屉里，孙小美千恩万谢，又说起了昨天节目排练中的糗事征求艾美丽对节目的改进意见，艾美丽只好将移液器交给钱多多。（实验中接电话已是不当，闲聊天罪加一等！）11.从艾美丽加第一个样品开始钱多多就用手机上的秒表进行了精确计时，快到时间了，看到艾美丽还被孙小美纠缠不清，钱多多继续往下做实验，毕竟实验是大事嘛！为了防止加错，钱多多提前半分钟把几个测定管拿出来放在实验台的试管架上。时间到！准时向测定管中加入NaOH！钱多多习惯从左向右加样，真受不了艾美丽这个左撇子。（提前拿出水浴无法保证最适温度，两人加液顺序正好是反的，时间完全错误，测定管的终止和前面的启动是最关键的，两人也没有任何强调的策略）12.酶促反应结束，转移1ml到刻度试管，为了节约枪头，平行样用一个枪头就可以啦！他们本来就应该是一样的嘛。（因为生物样品的未知性所以设置平行管以防止操作误差的影响，所以每个平行管都是完全独立的，必须换枪尖。）13.每个刻度试管中再加入1ml硝基水杨酸，沸水浴5分钟，稀释定容。（应该与标准曲线同步操作）14.和之前做好的标准曲线一起用722分光光度计测光吸收，用装蒸馏水的比色杯作为空白管，每次3个待测液，很快就测完了。（空白管应该是标准曲线第一个管。平行样品应该同批次测定。）15.钱多多和艾美丽边说边笑的收拾桌面，清洗器皿，把移液器刻度调到最大。实验结束，又快又好，稍稍美中不足的就是测定管平行样之间的OD值差得有点儿大，两人推测是分光光度计不稳定造成的吧，毕竟是用了十几年的老仪器了嘛！（测定管平行样差的大最最主要是因为酶促反应启动与终止的失误，次要原因是没有同批次测定OD值。）（版权声明：该纠错题为王娜老师版权所有！！）以上参考答案，欢迎大家质疑讨论。